1300 nm励起のみを使用する複数プローブの3Pイメージング
1300 nmのターンキーレーザ光源により短波長および長波長の蛍光プローブを励起することで、哺乳類神経科学の研究により「深く」取り組むことができます。
2022年8月29日、Coherent
蛍光タンパク質とプローブの3光子（3P）励起は、現在、特に神経科学分野での応用で大きな関心を集めています。 その大きな理由は、Chris Xu教授らが実証したように、3P励起に用いる1300 nmと1700 nmの波長域での透過深度が深いためです。
また、3光子励起は、焦点外蛍光をほとんど発生させることなく、2光子励起よりも高いS/Nを実現することもできます。これにより、生きたマウスの脳で、厚さ1 mmを超える大脳皮質の深部までイメージングすることが可能になりました。
それと同様に重要なことに、1300 nmの光は緑色蛍光タンパク質やデキストランなどのプローブで必要とされる3P励起エネルギーと一致します。一方、1700 nmの光は、tdTomatoのような長波長のターゲットを励起するために使用することができます。
一部の研究者は、複数のプローブを同時に励起して、哺乳類の脳をより精緻に調べたいと考えています。 このように情報量の多いデータを得られることで、神経のつながりや神経活動と重要な機能との関連性について、解明を加速させることができます。
短波長と長波長の両方を使用することで、両波長のプローブを同時に撮像することができます。 ただし、これにはいくつかの制限があります。 まず、両方の波長のビームを生成し、顕微鏡内で合成することの複雑さ（およびコスト）があります。 次に、出力負荷の問題があります。つまり、2つのレーザ光源を使用して生きている組織を励起することは、2倍のレーザを試料に照射することを意味します。 加えて、最近まで1300 nmと1700 nmのどちらにも対応したシンプルな（つまり「ワンボックス」）ソースがありませんでした。そのため、研究者は通常、1040 nm付近のレーザを使って、2つの波長それぞれに対して波長可変OPAを操作していました。
しかし、2つの進歩の組み合わせにより、短波長および長波長のプローブの同時3P励起がよりシンプルになり、その結果、より多くのユーザーが利用できるようになりました。
長波長プローブの1300 nm励起
最近のいくつかの3Pイメージング研究により、1300 nmで緑色と赤色の両方の蛍光プローブを励起できることが明らかになりました。 その後、2つのプローブからの光を、フィルターを使って2台のカメラで別々に検出します。 たとえば、Timo van Kerkoerle博士とその博士課程学生Marie Guillemant氏は、1300 nmに調整したMonacoとOpera-Fを用いた3P励起により、マウス前頭前野のデキストランとtdTomatoで標識した介在ニューロンの同時励起を実証しました（図1参照）。 このZスタック画像は、深さ1 mmまででも赤方偏移したプローブ励起信号が顕著であることを示しています。
データ提供：Timo van Kerkoerle博士、Marie Guillemant氏、 Neurospin、CEA Saclay。
図1.マウス前頭前野のデキストラン（緑色）とtdTomato（赤色）で標識した介在ニューロンの3Pイメージングで、深さ約1 mmまで到達。
Chris Xu教授は、2021年に多色蛍光体の単波長3P励起に関する論文を発表しました*。
この研究により、従来、1700 nmで最低エネルギーの励起状態に励起してイメージングしていた多くの一般的な赤色蛍光分子を、1300 nmでより高いエネルギーの電子状態に励起できることが示されました。 この新しい励起メカニズムにより、1300 nmのレーザ光のみでマウス脳内の緑色と赤色のデュアル3P蛍光イメージングが可能になりました。
Timo van Kerkoerle博士とChris Xu教授によるこれらの発見は、イメージングおよび機能性蛍光プローブの3P励起の今後の方向性に確実に影響を与えることでしょう。
1300 nmパルスのワンボックス型光源
もう一つの有用な進歩は、3P励起用の1300 nmのフェムト秒パルスの合理的な供給源となるワンボックス型の集積レーザの最近の開発です。 たとえば、新しいCoherent Monaco 1300は、パルス幅50 fs以下の使いやすい押しボタン式光源となっています。
この短いパルス幅は高いピークパワーが得られるため、3Pイメージングに最適であり、3P画像の明るさはレーザピークパワーの3乗に比例します。 また、この新しいレーザは最大2.5 Wの出力を持ち、1 MHz、2 MHz、または4 MHzの繰り返し周波数が可能で、高速な画像取得をサポートします。 加えて、レーザの円形高品質ビーム（M2 <1.3）により、3軸すべてで顕微鏡スループット、イメージング効率、画像解像度が最大化されます。
また、シングルボックスパッケージは、3Pイメージングを簡略化し、画像の明るさを向上させることができる2つの評判の良い機能のオプションを備えています。 事前の準備なしに出力減衰/ゲーティングを行うトータルパワーコントロール（TPC）機能と、試料での最適なパルス幅を実現するための分散プリコンペンセーションを行う小型パルスコンプレッサー（CPC）の2つのオプションがあります。
3Pイメージングの明るい未来
単一のレーザ光源で複数のプローブを励起することで、皮質層の深部にある複数の細胞タイプのマッピングに基づく、大脳の高速で情報量の多いイメージングが可能になり、神経科学分野の発展に寄与することが期待されています。 これらの3P励起技術やメカニズムの開発は、単一波長の3P励起光源と波長可変3P励起光源のどちらを選ぶか迷っている研究者や、Coherent Monaco 1300のようなソリューションの価値に目を向けている研究者の指針となるはずです。
当社ブログのCoherent Monaco 1300を参照してください。
*出典： マウス脳深部における単一波長励起によるマルチカラー3光子蛍光イメージング、Science Advances。
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