3P-Bildgebung von verschiedenen Proben mit nur 1300 nm Anregung

Die Drei-Photonen-Anregung (3P) von fluoreszierenden Proteinen und Proben stößt derzeit auf großes Interesse, insbesondere bei neurowissenschaftlichen Anwendungen. Ein wichtiger Grund ist die große Eindringtiefe in den Wellenlängenfenstern von 1300 nm und 1700 nm, die für die 3P-Anregung verwendet werden, wie von Chris Xu und anderen gezeigt wurde.  

Die Drei-Photonen-Anregung kann auch ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis liefern als die Zwei-Photonen-Anregung, wobei praktisch keine unscharfe Fluoreszenz auftritt.  Dies ermöglicht eine tiefere Bildgebung im lebenden Mäusegehirn, durch die gesamte Tiefe des > 1 mm dicken Kortex.   

Ebenso wichtig ist, dass das 1300-nm-Licht den Anforderungen an die 3P-Anregungsenergie von grün fluoreszierenden Proteinen und Proben wie Dextran entspricht, während das 1700-nm-Licht für die Anregung von langwelligeren Zielen wie tdTomato verwendet werden kann.

Einige Forscher würden gerne verschiedene Proben gleichzeitig anregen, um anspruchsvollere Abfragen des Säugetiergehirns durchzuführen. Solche informationsreichen Daten können das Verständnis dafür beschleunigen, wie neuronale Verbindungen und Aktivitäten mit wichtigen Funktionen zusammenhängen.

Durch die Verwendung beider Anregungswellenlängen können Proben mit kurzer und langer Wellenlänge gleichzeitig abgebildet werden. Dies hat jedoch einige Einschränkungen. Erstens ist es kompliziert (und teuer), Strahlen mit beiden Wellenlängen zu erzeugen und sie im Mikroskop zu kombinieren. Die Verwendung von zwei Laserquellen zur Anregung von lebendem Gewebe bedeutet, dass die doppelte Laserleistung auf die Probe einwirken muss. Außerdem gab es bis vor Kurzem keine einfache (d. h. „One-Box”) Quelle für 1300 nm oder 1700 nm, so dass die Forscher in der Regel einen Laser bei etwa 1040 nm verwendeten, um einen abstimmbaren OPA für jede der beiden Wellenlängen zu betreiben.

Aber die Kombination von zwei Entwicklungen hat die gleichzeitige 3P-Anregung von kurz- und langwelligen Sonden viel einfacher und damit für ein breiteres Anwenderfeld zugänglich gemacht.

1300 nm Anregung von langwelligen Sonden

Mehrere neuere 3P-Bildgebungsstudien haben gezeigt, dass 1300 nm zur Anregung sowohl grüner als auch roter Fluoreszenzsonden verwendet werden kann. Das Licht der beiden Proben wird dann mit Hilfe von Filtern in zwei Kameras getrennt erfasst. So haben Timo van Kerkoerle und seine Doktorandin Marie Guillemant die gleichzeitige Erregung von mit Dextran und tdTomato markierten Interneuronen im präfrontalen Kortex der Maus durch 3P-Anregung mit einem auf 1300 nm abgestimmten Monaco und Opera-F nachgewiesen (Abbildung 1). Das Z-Stapel-Bild hier zeigt, dass das rotverschobene Anregungssignal der Probe sogar bis zu einer Tiefe von ~1 mm signifikant ist.

Daten mit freundlicher Genehmigung von Timo van Kerkoerle, Ph.D., und Marie Guillemant, Neurospin, CEA Saclay.

Abbildung 1. 3P-Bildgebung von mit Dextran (grün) und tdTomato (rot) markierten Interneuronen im präfrontalen Kortex der Maus, die eine Tiefe von ~1 mm erreichen.

Chris Xu veröffentlichte im Jahr 2021 einen Artikel über die 3P-Anregung von mehrfarbigen Fluorophoren mit einer einzigen Wellenlänge*

Diese Arbeit hat gezeigt, dass viele bekannte rot fluoreszierende Moleküle, die üblicherweise mit einer 1700-nm-Anregung auf den niedrigsten angeregten Zustand abgebildet wurden, auch mit 1300 nm auf einen höher energetischen elektronischen Zustand angeregt werden können. Dieser neuartige Anregungsmechanismus ermöglicht eine duale grüne und rote 3P-Fluoreszenz-Bildgebung im Mäusegehirn mit nur 1300 nm Laserlicht. 

Wir glauben, dass diese Erkenntnisse von Timo van Kerkoerle und Chris Xu einen deutlichen Einfluss auf die zukünftige Richtung der 3P-Anregung von bildgebenden und funktionellen Fluoreszenzproben haben werden. 

Eine Ein-Box-Quelle für 1300 nm Pulse  

Ein weiterer nützlicher Fortschritt ist die jüngste Entwicklung von integrierten One-Box-Lasern, die eine optimierte Quelle für 1300 nm Femtosekundenpulse zur 3P-Anregung bieten. Ein Beispiel dafür ist der neue Coherent Monaco 1300, eine einfach auf Knopfdruck zu bedienende Quelle mit einer Pulsbreite von weniger als 50 fs. 

Diese kurze Pulsbreite ist ideal für die 3P-Bildgebung, da sie eine hohe Spitzenleistung liefert und die Helligkeit des 3P-Bildes proportional zur Kubikzahl der Laser-Spitzenleistung ist. Dieser neue Laser liefert außerdem bis zu 2,5 W Leistung mit einer Wiederholrate von wahlweise 1, 2 oder 4 MHz und unterstützt damit eine schnelle Bildaufnahme. Darüber hinaus maximiert der kreisförmige, qualitativ hochwertige (M² <1,3) Laserstrahl den Durchsatz des Mikroskops, die Effizienz der Bildgebung und die Bildauflösung in allen drei Achsen.

Das Single-Box-Paket enthält auch die Option von zwei beliebten Funktionen, die die 3P-Bildgebung vereinfachen und die Bildhelligkeit verbessern können. Dabei handelt es sich um die Funktion Total Power Control (TPC), die eine fliegende Leistungsabschwächung bzw. -steuerung ermöglicht, und einen Compact Pulse Compressor (CPC), der eine Dispersionsvorkompensation für eine optimale Pulsbreite an der Probe bietet. 

Eine glänzende Zukunft für die 3P-Bildgebung 

Die Verwendung einer einzigen Laserquelle zur Anregung verschiedener Proben verspricht einen Fortschritt auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, indem sie eine schnelle, informationsreiche Bildgebung großer Hirnvolumina ermöglicht, die auf der Kartierung mehrerer Zelltypen tief in den Kortikalschichten basiert. Diese Entwicklungen in der 3P-Anregungstechnologie und -mechanik sollten Forschern bei der Entscheidung helfen, ob sie eine durchstimmbare oder eine 3P-Anregungsquelle mit einer einzigen Wellenlänge bevorzugen, und sie unterstreichen den Wert von Lösungen wie dem Coherent Monaco 1300.

Lesen Sie mehr über den Coherent Monaco 1300 in unserem Blog.

* Quelle: Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain, Science Advances.

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