1300nm 여기만 사용한 여러 프로브의 3P 이미징
1300nm의 턴키 소스를 사용하면 단파장 형광 프로브와 장파장 형광 프로브를 동시에 자극하면서 실제적으로나 잠재적으로 포유류 신경과학에 대해 더 깊이 연구할 수 있습니다.
2022년 8월 29일, Coherent
현재, 형광 단백질 및 프로브의 3광자(3P) 여기는 특히 신경과학 응용 분야에서 많은 관심을 모으고 있습니다. 가장 큰 이유는 Chris Xu 및 일부 연구원들이 증명한 바와 같이 3P 여기에 사용되는 1300nm 및 1700nm 파장 윈도우에서의 긴 침투 깊이 때문입니다.
또한 3광자 여기는 초점이 맞지 않는 형광이 거의 없는 2광자 여기보다 더 높은 신호 대 잡음을 전달할 수도 있습니다. 따라서 1mm 이상 두께 피질의 완전한 깊이까지 살아 있는 쥐의 뇌에서 보다 심층적인 이미징이 가능합니다.
그리고 1700nm 빛은 tdTomato와 같은 더 긴 파장 대상을 자극하는 데 사용할 수 있는 반면, 1300nm 빛은 녹색 형광 단백질과 덱스트란과 같은 프로브의 3P 여기 에너지 요구 사항을 충족한다는 점도 중요합니다.
일부 연구원들은 포유류 뇌를 보다 정교하게 파악하기 위해 동시에 여러 프로브를 자극할 수 있기를 원합니다. 정보가 풍부한 데이터를 이용하면 신경 연결 및 활동이 중요한 기능과 어떻게 관련되어 있는지 파악하는 과정을 촉진할 수 있습니다.
두 가지 여기 파장을 사용하여 단파장 및 장파장 프로브를 동시에 이미징화할 수 있습니다. 하지만 여기에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 두 파장 모두에서 빔을 생성하고 이를 현미경으로 결합하는 복잡성(및 비용)이 있습니다. 그리고 전력 부하 문제가 있습니다. 즉, 살아 있는 조직을 자극하기 위해 두 개의 레이저 소스를 사용한다는 것은 샘플에 두 배의 레이저 출력을 사용해야 함을 의미합니다. 또한 최근까지 1300nm 또는 1700nm를 위한 간단한 소스(즉, "원박스")가 없었기 때문에, 연구원들은 전형적으로 약 1040nm에서 레이저를 사용하여 두 파장 각각에 대해 조정 가능한 OPA를 구동했을 것입니다.
이제는 두 가지 발전 사항을 결합함으로써 단파장 및 장파장 프로브의 동시 3P 여기가 훨씬 더 간단해졌으며, 이에 따라 더 넓은 사용자층이 쉽게 이용할 수 있게 되었습니다.
장파장 프로브의 1300nm 여기
최근 일부 3P 이미징 연구에 따르면 1300nm를 사용하여 녹색 및 적색 형광 프로브를 자극할 수 있는 것으로 나타났습니다. 두 프로브에서 나오는 빛은 필터를 사용하여 두 대의 카메라에서 별도로 감지됩니다. 예를 들어 Timo van Kerkoerle과 박사과정 학생인 Marie Guillemant는 1300nm로 조정된 Monaco 및 Opera-F를 사용하여 3P 여기를 통해 쥐의 전두엽 피질에서 덱스트란 및 tdTomato 표식 중간 뉴런의 동시 여기를 입증했습니다(그림 1). 여기서 z-스택 이미지는 적색 편이 프로브 여기 신호가 약 1mm 깊이까지도 중요하다는 것을 보여줍니다.
데이터 제공: Timo van Kerkoerle 박사 및 Marie Guillemant, CEA Saclay의 Neurospin
그림 1. 쥐의 전두엽 피질에서 덱스트란(녹색) 및 tdTomato(적색) 표식 중간 뉴런의 3P 이미징으로 약 1mm 깊이에 도달함을 보여줍니다.
Chris Xu는 2021년에 다색 형광단의 단일 파장 3P 여기에 대한 논문을 발표했습니다.*
이 연구는 전통적으로 1700nm 여기를 사용하여 가장 낮은 에너지 여기 상태로 이미징화되었던 많은 일반적인 적색 형광 분자가 1300nm까지 더 높은 에너지 전자 상태로 자극될 수 있음을 보여주었습니다. 이 새로운 여기 메커니즘은 1300nm 레이저 광만 사용하여 쥐의 뇌에서 이중 녹색 및 적색 3P 형광 이미징을 가능하게 합니다.
Coherent는 Timo van Kerkoerle 및 Chris Xu의 이러한 연구 결과가 이미징 및 기능적 형광 프로브의 3P 여기에 대한 향후 방향에 분명히 영향을 미칠 것이라고 생각합니다.
1300nm 펄스의 원박스 소스
또 한 가지 유용한 진전 사항은 최근 개발된 원박스 통합 레이저로, 이러한 레이저는 3P 여기를 위한 1300nm 펨토초 펄스에 대해 간소화된 소스를 제공합니다. 한 예로서 사용이 간편하고 푸시 버튼을 갖춘 펄스 폭이 50fs 미만인 새로운 Coherent Monaco 1300을 들 수 있습니다.
이와 같은 짧은 펄스 폭은 높은 피크 전력을 생성하고 3P 이미지 밝기가 레이저 피크 전력의 세제곱에 비례하기 때문에 3P 이미징에 이상적입니다. 이 새로운 레이저는 또한 최대 2.5W의 출력을 제공하고 1MHz, 2MHz 또는 4MHz 반복률로 작동할 수 있어서 빠르게 이미지를 획득할 수 있습니다. 그뿐만 아니라 레이저의 원형 고품질(M2 <1.3) 빔은 세 축 모두에서 현미경 처리량, 이미징 효율성 및 이미지 해상도를 극대화합니다.
이 단일 박스 패키지에는 3P 이미징을 단순화하고 이미지 밝기를 개선할 수 있는 두 가지 실용적인 기능에 대한 옵션도 포함되어 있습니다. 두 가지 기능이란 즉각적인 전력 감쇠/게이팅을 제공하는 전체 출력 제어(TPC)와 샘플에서 최적의 펄스 폭을 위한 분산 사전 보상을 제공하는 소형 펄스 압축기(CPC)입니다.
3P 이미징의 밝은 미래
여러 프로브를 자극하는 데 단일 레이저 소스를 사용하면 피질층에 걸쳐 깊이 다중 세포 유형 매핑을 기반으로 큰 뇌 부피에 대해 신속하고 정보가 풍부한 이미징이 가능해짐으로써 신경과학 분야를 발전시킬 수 있다는 점에서 전망이 밝습니다. 아울러, 3P 여기 기술 및 메커니즘에 대한 이러한 발전은 연구원들이 조정 가능한 소스와 단일 파장 3P 여기 소스 중에서 어느 것을 선택할지 여부를 결정하고 Coherent Monaco 1300과 같은 솔루션의 가치를 이해하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.
Coherent의 블로그에서 Coherent Monaco 1300에 대해 자세히 읽어보십시오.
* 출처: 쥐의 뇌 깊은 곳에 단일 파장 여기를 이용해 나타낸 다색 3광자 형광 이미징, Science Advances
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