記事

概要

1990年に発表された2光子レーザ走査型蛍光顕微鏡の発展的な研究（Denk, et al., 1990）以来、この技術はレーザ技術の段階的変化の恩恵を受けてきました。 これらの進歩により、物理学研究室から始まって、細胞生物学、疾病研究、高度な神経科学イメージングに至るまで、技術が普及してきました。

2001年頃に、ワンボックス型の波長可変チタンサファイアレーザからこの傾向が始まりました。数年後、顕微鏡のサンプル表面におけるパルス幅を最適化するために、自動分散制御がレーザに追加されました。 チタンサファイアレーザの上限よりも長い波長で励起できるプローブが成熟して効率化されたため、2010年以降、レーザ会社は、カラーパレットの増加、より深いイメージング、光損傷の減少といったニーズに取り組むため、光パラメトリックオシレータに注目するようになりました。

この記事では、この進化の次のフェーズ、つまり高速電力変調のレーザシステムへの統合、およびこれによるセットアップ時間の短縮、パフォーマンスの最大化、所有コストの低減を実現する方法について説明します。 

2光子顕微鏡のレーザ出力制御に対する要件。

最も単純な形態としては、位相遅延波長板と偏光アナライザを追加することで、レーザ出力の連続制御を実現できます。 波長板を回転させることにより、アナライザを通過するレーザ出力の透過率を通常0.2%～99%に変更できます。 波長板を電動化することにより、このプロセスを自動化して顕微鏡のイメージング面での出力を変更できます。たとえば、異なる深さのフレームで集光フルエンスを均等化できます。

しかし、最新のレーザスキャン2光子顕微鏡のほとんどでは、より高速な変調速度が必要です。 たとえば、データ収集を一方向にのみ行うラスターレーザスキャン用途では、不要な蛍光励起やフォトブリーチングを避けるために、「フライバック動作」中にレーザをブランキングする必要があります。 共振型のガルボスキャナーの場合、立ち上がり / 立ち下がり時間は数マイクロ秒にもなります。 この領域では、光変調方式を検討する必要があります。 

電気光学変調

電気光学変調器（EOM）は、ポッケルス効果を利用してビームの位相を遅延させることにより、レーザ出力を変調します。 ここでは、電界の印加によって中心対称でない結晶に複屈折が引き起こされます。 以前と同様に、偏光アナライザを使用して変調器のセットアップを完了させます。

ポッケルスセルは、比較的短い結晶で大きなビームに対応するため、縦方向励起の配置で構成されることもあります。 この場合、標準的な半波長電圧（例 : 偏光を90度回転させるのに必要な電圧）は6 kV程度であり、2P顕微鏡に必要な速度とデューティサイクルで実現することは困難です。 そのため、イメージング用のほとんどの構成では横電場の配置が採用されており、より長い結晶を使用して半波長電圧を大幅に低下させています。 結晶は通常2個以上直列に配置し、互いに回転させ、必要なスイッチング電圧をさらに下げて熱負荷の影響を補償します。

最良の画像コントラストを得るには、結晶のアライメントとオフセット（バイアス）電圧を調整して、パルスコントラスト（送信電力の最小値と最大値の比）を最適化するように注意する必要があります。 

ポッケルスセルは2光子顕微鏡で広く採用されています。比較的簡単に配置されるため、特に「内製メーカー」コミュニティで、とりわけ一般的な2光子波長でわずかなパワーしか必要としないユーザーが利用しています。 

たとえば、リン酸二重水素化カリウム（KD*P）をベースにしたセルは、約1100 nmまでの2P用途に対して、優れた透過率、速度、コントラスト特性を適度なレーザ出力で発揮します。 さらに、KD*Pはグループ速度分散特性が低いため、グループ遅延分散（GDD）が最小限に抑えられます。 このため、KD*Pポッケルスセルは、チタンサファイアレーザのような分散の事前補正やチューニング制限のないウルトラファーストレーザを使用する場合によく採用されます。 

音響光学変調

音響光学変調器（AOM）は、圧電振動子が取り付けられた透明な水晶またはガラスから構成されています。 振動子に高周波（RF）を印加すると、振動子から発生する音波によって結晶が歪み、屈折率格子が発生します。 そして、セル内を進む光はブラッグ回折を起こします。

立ち上がり / 立ち下がり時間は、音波がレーザビームを通過する時間に比例するため、結晶内のビーム幅を小さくすることにより最適化できます。 

弁別とコントラスト比は、0次と1次の回折次数間の分離角度（θ_S）と、対象の作業面までの距離の両方によって定義されます。

2光子顕微鏡で使用される最も一般的なAOM材料は、二酸化テルル（TeO₂）です。 この材質は、広い波長範囲での優れた回折効率と高出力処理が実証されています。 30dBm程度という少なめのRF出力で伝送効率を最大化できます。

TeO₂ AOMは通常、ブラッグ相互作用レジームで構成されており、1次の回折効率が最も高く、それより高い次数の回折は破壊的に消滅します。 最小限のRF出力レベルで高い効率を実現するには、1 cmを超える結晶長が必要で、グループ遅延分散（GDD）が無視できなくなることに注意してください。 また、他の下流の光学部品、特に対物レンズの分散を考慮すると、AOMベースの顕微鏡システムでは、サンプル表面で最短パルスを維持するために、分散事前補正を備えたレーザと組み合わせるとメリットがあります。

波長可変レーザ用AOMの導入には、光学設計と制御エレクトロニクス設計の両方を注意深く行う必要があります。 分離角（θ_s）は、RF駆動周波数（つまりグレーティング周期）とレーザ波長の両方に依存するため、レーザ波長を調整する際には、RF駆動周波数を注意深く較正してポインティングの変化を最小限に抑える必要があります。 さらに、回折効率が最大になるRF出力は、波長によって異なります。 波長可変のイメージングシステムでは、RFの周波数と出力を注意深く制御し、比較的大きなGVDを管理する必要があるため、優れた性能特性が得られるにもかかわらず、これまで多くの内製用設定やカスタム設定でのAOMの使用は限られていました。 

広帯域波長可変レーザでの変調

波長が680～1300 nmで出力2 Wを超える、ワンボックス型で広範囲の波長可変レーザの登場により、レーザ変調に対する新しい体制での性能と集積化への取り組みが必要とされています。

通常使用されているKD*Pポッケルスセルでは、高出力時にサーマルブルーミング効果が生じるため、ビームポインティング、ビームウエストの完全性、寿命に悪影響が及びます。 波長が長くなるほど、駆動電圧とコントラストの問題が大きくなります。 タンタル酸リチウムは、より広い波長可変が可能なEOM材料ですが、市販品のグループ遅延の分散は分散補正型レーザの修正可能範囲より大きいため、パルスが長くなり、ピークパワーが低下し、効率的なイメージングに支障をきたします。

前述のように、AOMベースのソリューションはコストや性能面でのメリットが期待できますが、導入には高度な光学設計と電子制御の専門知識が必要であるため、多くのバイオイメージング施設では容易に利用できない場合がよくあります。 とはいえ、AOMソリューションは一部の顕微鏡メーカーから統合ソリューションとして市販されています。

2017年、Coherentは、AOM変調をレーザ光源と統合したターンキーソリューションがユーザーと顕微鏡業界の双方にメリットを生み出すことに気付きました。 Coherentは、産業用ウルトラファースト加工レーザの統合AOMソリューションで収集したノウハウを基に、Chameleon Discoveryレーザの完全統合オプションとして、Total Power Control（TPC）を開発しました。

Total Power Controlは、Chameleon Discovery NXで利用でき、ハンズフリーの自動パッケージで、フルオクターブのチューニングレンジである660 nm～1320 nmにわたって高いコントラスト（1000 : 1以上）と高速な（立ち上がり時間1 μs未満）変調を実現します。 

RF周波数と出力の較正や調整といった負担の重い要求事項はすべてレーザ内部でプログラミングされるため、ユーザーや顕微鏡のインテグレーターに求められるのは、必要とする設定波長と出力レベルの提供だけです。

AOMは非常にコスト効率に優れているため、Chameleon Discovery NX TPCの固定波長1040 nm出力には専用のAOMとドライバも装備されています。出力はシリアル /USBコマンドまたは高速アナログ制御入力のいずれかで適切に制御できます。

将来の動向

2光子イメージング技術の範囲がOEMや前臨床用途に拡大するにつれ、単一波長でコスト効率の高いフェムト秒光源への需要が高まりつつあります。 コンパクトな超高速光源Axonシリーズは、これらの要求に完璧に対応できます。

製品コンセプトの段階から、TPC機能はAxonの設計に統合され、新しい顕微鏡の設計や用途への導入が簡素化されました。 これにより、2光子顕微鏡システムは純粋な研究機器ではなく、移動可能な診断機器、臨床機器、ハイスループットスクリーニング機器の一部となり、統合によるきわめて高い利便性を用途にもたらすことができます。 

最先端の神経科学研究における高出力レーザは、光遺伝学的な刺激を用いた全光学的な生体内イメージング技術の分野で重要な役割を担っています（Yuste, 2012）。 空間光変調器（SLM）により、数十ワットのレーザ出力が数十から数百の神経細胞に個別に扱うことができるビームレットに分割されます。 この光制御方式では、短くて個別の要求に対応できるバーストパルスが必要です。 Coherent Monacoのような高出力ファイバーレーザは、全ファイバー設計フォーマットにより、これらの用途に要求される柔軟性を提供します。 その結果、高い平均出力で高エネルギーのレーザが必要となり、さらに1ミリ秒未満のタイムスケールで刺激ビームのオン / オフを切り替える必要があるため、これらの要件を満たすことが既存のポッケルスセル技術に対する特有の課題となります。 この課題の解決に向けて、絶妙なパルス制御、顕微鏡設計の簡素化、イメージングシステムの信頼性の向上のために、AOM技術はMonacoに完全に統合されました。 

まとめ

本テクニカルノートでは、2光子顕微鏡で使用するフェムト秒レーザのレーザ出力を変調するための2つの主要なアプローチである、電気光学変調と音響光学変調について述べました。 EOMは高電圧を出力する機器を光路上に配置することが比較的容易なため、現在ほとんどの「内製メーカー」がEOMを採用しています。 さまざまな顕微鏡販売会社がEOMかAOMのいずれかをレーザ伝送トレインに部分的に統合し、その販売会社のソフトウェアアーキテクチャで顕微鏡とレーザの両方を制御しています。 Coherentは、24時間365日稼働する製造環境向けに設計された高出力ファイバーレーザの製造経験を活かし、サイズ、コスト、スピード、性能全般の面でAOMを利用するメリットが2光子イメージング用途の要求を満たすことを認識しました。 AOMの洗練された制御をDiscovery NX、Axon、Monacoのレーザソフトウェアとハードウェアアーキテクチャに統合することにより、2光子のユーザー（内製メーカーと顕微鏡販売会社の両方）は、最先端の神経科学から医療診断に至るまで、光学系設定が大幅に簡素化されて制御がより簡単になる恩恵を受けることができます。