ARTIKEL

Lasermodulationslösungen
für die Zwei-Photonen-Mikroskopie

Überblick

Seit der bahnbrechenden Arbeit zur Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie, die im Jahr 1990 veröffentlicht wurde (Denk, et al., 1990), hat die Technik von schrittweisen Veränderungen in der Lasertechnologie profitiert. Diese Verbesserungen haben dazu beigetragen, dass die Technik vom Physiklabor in die Zellbiologie, die Erforschung von Krankheiten und die fortgeschrittene neurowissenschaftliche Bildgebung vordringen konnte.

Durchstimmbare One-Box-Ti:Saphir-Laser haben diesen Trend um das Jahr 2001 eingeleitet. Einige Jahre später wurden die Laser mit einer automatischen Dispersionskontrolle ausgestattet, um die Pulsdauer auf der Probenebene des Mikroskops zu optimieren. Da die Bereiche anregbarer Wellenlängen bei Sonden, die länger sind als die Obergrenze von Ti:Saphir-Lasern, immer ausgereifter und effizienter wurden, wandten sich die Laserhersteller nach 2010 optischen parametrischen Oszillatoren zu, um diesen Bedarf an einer erweiterten Farbpalette, einer tieferen Bildgebung und einer geringeren Lichtschädigung zu decken.

In diesem Artikel erörtern wir die nächste Phase in dieser Entwicklung: die Integration der schnellen Leistungsmodulation in das Lasersystem und wie dies eine schnellere Einrichtung, höchste Leistung und niedrige Betriebskosten ermöglicht. 

 

Anforderungen an die Steuerung der Laserleistung in der Zwei-Photonen-Mikroskopie.

In seiner einfachsten Form kann eine kontinuierliche Kontrolle der Laserleistung durch Hinzufügen einer phasenverzögernden Wellenplatte und eines Polarisationsanalysators erreicht werden. Durch Drehen der Wellenplatte kann die Transmission der Laserleistung durch den Analysator typischerweise von 0,2 % Transmission auf etwa 99 % verändert werden. Durch die Motorisierung der Wellenplatte kann dieser Prozess automatisiert werden, um die Leistung in der Abbildungsebene des Mikroskops zu verändern, um z. B. fokussierte Fluences in verschiedenen Tiefenrahmen auszugleichen.

Die meisten modernen Laser-Scanning-Zwei-Photonen-Mikroskope benötigen jedoch eine höhere Modulationsgeschwindigkeit. Bei einer Raster-Laser-Scan-Anwendung, bei der die Datenerfassung nur in einer einzigen Richtung erfolgen soll, muss der Laser während des „Flyback-Betriebs“ ausgeblendet werden, um unerwünschte Fluoreszenzanregungen oder Photobleaching zu vermeiden. Im Fall von resonanten galvometrischen Scannern können die resultierenden Anstiegs-/Abfallzeiten nur wenige Mikrosekunden betragen. In diesem Bereich muss man optische Modulationsmethoden in Betracht ziehen. 

 

Elektrooptische Modulation

Ein elektro-optischer Modulator (EOM) moduliert die Laserleistung, indem er den Strahl mit Hilfe des Pockels-Effekts in der Phase verzögert. Hier wird die Doppelbrechung in einem nicht-zentrosymmetrischen Kristall durch Anlegen eines elektrischen Feldes induziert. Wie zuvor wird ein Polarisationsanalysator verwendet, um die Einrichtung des Modulators zu vervollständigen.

Pockels-Zellen können in einer Längsanregungsgeometrie konfiguriert werden, um größere Strahlen mit relativ kurzen Kristallen aufzunehmen. In diesem Fall liegt die typische 1⁄2-Wellenspannung (d. h. die Spannung, die für eine 90-Grad-Drehung der Polarisation erforderlich ist) in der Größenordnung von 6 kV, was bei den für die 2P-Mikroskopie erforderlichen Geschwindigkeiten und Arbeitszyklen schwierig zu erreichen ist. Daher verwenden die meisten Konfigurationen für die Bildgebung eine Geometrie mit transversalem elektrischem Feld, bei der längere Kristalle zum Einsatz kommen, was die Halbwellenspannung erheblich senkt. Die Kristalle werden im Allgemeinen in 2 oder mehr seriellen Konfigurationen eingesetzt, die gegeneinander verdreht sind, um die erforderliche Schaltspannung weiter zu senken und thermische Belastungseffekte zu kompensieren.

Es muss darauf geachtet werden, den Pulskontrast (Verhältnis zwischen minimaler und maximaler Sendeleistung) zu optimieren, indem die Kristalle ausgerichtet und die Offset-Spannung (Vorspannung) angepasst wird, um den besten Bildkontrast zu erzielen. 

Pockels-Zellen sind in der Zwei-Photonen-Mikroskopie weit verbreitet, vor allem in der „Eigenbauer“-Community, da sie relativ einfach eingesetzt werden können, insbesondere für Benutzer, die nur bescheidene Leistungen bei gängigen Zwei-Photonen-Wellenlängen benötigen. 

Zum Beispiel bieten Zellen auf der Basis von Kaliumdideuteriumphosphat (KD*P) hervorragende Transmissions-, Geschwindigkeits- und Kontrasteigenschaften für 2P-Anwendungen bis zu etwa 1.100 nm und bescheidene Laserleistungen. Darüber hinaus weist KD*P eine geringe Gruppengeschwindigkeitsdispersion auf, was zu einer minimalen Gruppenlaufzeitdispersion (GDD) führt. Aus diesem Grund sind KD*P Pockels-Zellen eine beliebte Wahl bei der Verwendung von Ultrafast Lasern ohne Dispersionsvorkompensation und begrenzter Abstimmung, wie z. B. Ti:Saphir-Lasern. 

 

Akusto-optische Modulation

Ein akusto-optischer Modulator (AOM) besteht aus einem transparenten Kristall oder Glas, auf dem ein piezoelektrischer Wandler angebracht ist. Eine Hochfrequenzwelle (RF), die an den Wandler angelegt wird, induziert eine akustische Welle, die den Kristall anspannt, was zu einem Brechungsindex-Gitter führt. Das Licht, das die Zelle durchquert, unterliegt dann der Bragg-Beugung.

Die erreichbare Anstiegs-/Abfallzeit ist proportional zu der Zeit, die die akustische Welle benötigt, um den Laserstrahl zu durchqueren, und wird daher durch Verringerung der Breite des Strahls im Kristall optimiert. 

Die Diskrimination und damit das Kontrastverhältnis wird sowohl durch den Trennungswinkel (θS) zwischen der nullten und der ersten Beugungsordnung als auch durch den Abstand zur interessierenden Arbeitsebene definiert.

Das in der Zwei-Photonen-Mikroskopie am häufigsten verwendete AOM-Material ist Telluriumdioxid, (TeO2). Dieses Material weist eine ausgezeichnete Beugungseffizienz und eine hohe Leistung über einen großen Wellenlängenbereich auf. Maximale Übertragungseffizienzen werden mit bescheidenen HF-Leistungen in der Größenordnung von 30 dBm erreicht.

TeO2-AOMs werden normalerweise im Bragg-Wechselwirkungsregime konfiguriert, das die beste Beugungseffizienz bis zur ersten Ordnung bietet, wobei höhere Ordnungen zerstörend annihiliert werden. Beachten Sie, dass zum Erreichen einer hohen Effizienz bei minimalen HF-Leistungspegeln Kristalllängen von >1 cm erforderlich sind, was zu einer nicht vernachlässigbaren Gruppenlaufzeitdispersion (GDD) führt. In Anbetracht der Dispersion anderer nachgeschalteter Optiken, insbesondere des Objektivs, profitieren AOM-basierte Mikroskopsysteme von der Kombination mit Lasern, die mit einer Dispersionsvorkompensation ausgestattet sind, um die kürzesten Pulse in der Probenebene zu erhalten.

Der Einsatz von AOMs für abstimmbare Laser erfordert sowohl ein sorgfältiges optisches als auch ein elektronisches Design. Da der Trennungswinkel (θs) sowohl von der HF-Antriebsfrequenz (d. h. der Gitterperiode) als auch von der Laserwellenlänge abhängt, muss die HF-Antriebsfrequenz sorgfältig kalibriert werden, um beim Abstimmen der Laserwellenlänge eine minimale Änderung der Ausrichtung zu gewährleisten. Außerdem wird die maximale Beugungseffizienz bei unterschiedlichen HF-Leistungen für verschiedene Wellenlängen erreicht. Der höhere Integrationsaufwand, der sich aus der Notwendigkeit ergibt, die HF-Frequenz und -Leistung sorgfältig zu kontrollieren und eine relativ große GVD in einem durchstimmbaren Bildgebungssystem zu verwalten, hat bisher die Verwendung von AOM in vielen Eigenbau- und kundenspezifischen Umgebungen eingeschränkt, trotz der hervorragenden Leistungsmerkmale. 

 

Modulation in weit abstimmbaren Lasern

Das Aufkommen von weit durchstimmbaren One-Box-Lasern in der Größenordnung von 680-1.300 nm und mit Leistungen von mehr als 2 W erfordert eine neue Art von Leistung und Integrationsaufwand für die Lasermodulation.

Die typischerweise verwendeten KD*P Pockels-Zellen weisen bei hoher Leistung thermische Überstrahlungseffekte auf, die sich nachteilig auf die Strahlausrichtung, die Integrität der Strahltaille und die Lebensdauer auswirken. Längere Wellenlängen stellen zudem eine größere Herausforderung für die Antriebsspannung und den Kontrast dar. Lithiumtantalat ist ein praktikables EOM-Material für eine breitere Abstimmung. Allerdings ist die Gruppenlaufzeitdispersion kommerzieller Geräte höher als der korrigierbare Bereich dispersionskompensierter Laser, was zu längeren Pulsen und geringerer Spitzenleistung führt. Das ist einer effizienten Bildgebung abträglich.

Wie bereits erwähnt, erfordern AOM-basierte Lösungen trotz ihrer potenziellen Kosten- und Leistungsvorteile ein hohes Maß an Fachwissen in den Bereichen optisches Design und elektronische Steuerung, das in vielen Bioimaging-Einrichtungen nicht ohne weiteres verfügbar ist. Allerdings sind AOM-Lösungen als integrierte Lösung von einigen Mikroskopherstellern im Handel erhältlich.

Im Jahr 2017 erkannte Coherent, dass sowohl die Anwender als auch die Mikroskopindustrie von einer gebrauchsfertigen Lösung profitieren würden, die die AOM-Modulation mit den Laserquellen integriert. Aufbauend auf der Erfahrung mit integrierten AOM-Lösungen für industrielle Ultrafast Bearbeitungslaser hat Coherent die Total Power Control (TPC) entwickelt – als vollständig integrierte Option für den Chameleon Discovery Laser.

Die Total Power Control, die auf dem Chameleon Discovery NX verfügbar ist, bietet einen hohen Kontrast (>1.000:1) und eine hohe Geschwindigkeit (<1 μs Anstiegszeit) bei der Modulation über einen vollen Oktavbereich von 660 nm bis 1.320 nm in einem automatischen Paket. 

Alle anspruchsvollen Anforderungen an die Kalibrierung und Einstellung der HF-Frequenz und -Leistung sind intern im Laser programmiert, so dass der Benutzer oder der Mikroskop-Integrator nur noch die gewünschte Wellenlänge und Leistung angeben muss.

Da AOMs sehr kosteneffizient sind, ist der 1.040 nm Ausgang des Chameleon Discovery NX TPC ebenfalls mit einem eigenen AOM und Treiber ausgestattet. Die Stromversorgung kann entweder über serielle/USB-Befehle oder über einen schnellen analogen Steuereingang gesteuert werden. 

 

Zukunftstrends

Da der Anwendungsbereich der Zwei-Photonen-Bildgebungstechniken immer weiter in den Bereich der OEM- und präklinischen Anwendungen vordringt, steigt die Nachfrage nach kosteneffizienten Femtosekundenquellen mit einer Wellenlänge. Die kompakten Ultrafast Lichtquellen der Axon-Serie erfüllen diese Anforderungen perfekt.

Bereits in der Konzeptphase wurde die TPC-Fähigkeit in das Axon-Design integriert, um den Einsatz in neuen Mikroskop-Designs und Anwendungen zu vereinfachen. Dies bietet ultimativen Integrationskomfort für Anwendungen, bei denen das Zwei-Photonen-Mikroskopsystem Teil eines beweglichen diagnostischen, klinischen oder eines Screening-Geräts mit hohem Durchsatz und kein reines Forschungsinstrument ist. 

In der modernen neurowissenschaftlichen Forschung spielen Hochleistungslaser eine Schlüsselrolle bei rein optischen In-vivo-Bildgebungsverfahren, die optogenetische Stimulation verwenden (Yuste, 2012). Mehrere Dutzend Watt Laserleistung werden mit räumlichen Lichtmodulatoren (SLMs) in einzelne Beamlets aufgeteilt, die individuell Dutzende oder Hunderte von Neuronen ansprechen können. Diese Methode der optischen Kontrolle erfordert kurze und maßgeschneiderte Pulssequenzen. Hochleistungs-Faserlaser wie der Coherent Monaco bieten dank des Ganzfaserdesigns die für diese Anwendungen erforderliche Flexibilität. Die daraus resultierende hohe Durchschnittsleistung, der hohe Energiebedarf des Lasers und die Notwendigkeit, den Stimulationsstrahl innerhalb einer Zeitspanne von weniger als einer Millisekunde zu wechseln, stellen eine besondere Herausforderung für die etablierte Pockels-Zelltechnologie dar. Zu diesem Zweck wurde die AOM-Technologie vollständig in Monaco integriert, um eine exquisite Pulskontrolle, ein vereinfachtes Mikroskopdesign und eine erhöhte Zuverlässigkeit des Bildgebungssystems zu gewährleisten. 

Figure 1
Abbildung 1: Vereinfachte Darstellung des Betriebs der transversalen Pockels-Zelle. Die Transmission durch den Analysator wird durch die Einstellung des angelegten elektrischen Feldes moduliert.
 
Figure 2
Abbildung 2: Typischer Einsatz einer Pockels-Zelle auf einem Zwei-Photonen-Mikroskop. Das EOM befindet sich direkt unter der rechten Hand des Benutzers. Foto mit freundlicher Genehmigung des Packer Lab, Universität Oxford, Vereinigtes Königreich.
 
Acousto-Optic Modulation
Figure 3
Abbildung 3: Chameleon Discovery NX TPC und typische maximale Ausgangsleistung nach Modulation
Figure 4
Abbildung 4: Die mitgelieferte GUI kann verwendet werden, um die Ausgangsleistung direkt zu ändern. Alternativ kann der Benutzer einen zusätzlichen schnellen Analogeingang für Flyback-Blanking und schnelle Dither-Steuerung bereitstellen. 
 
Figure 5
Abbildung 5: Ein Beispiel für Kalziumaufnahmen mit hohem Kontrast und schneller Bildwiederholrate, die durch Discovery TPC ermöglicht werden.
 
(Überlagerung von Neuronen, die RCaMP1.07 exprimieren, angeregt bei 1.100 nm (rot), und Astrozyten, die GCaMP6s exprimieren, angeregt bei 940 nm (grün), in-vivo, Maus. Anregungsquelle Chameleon Discovery TPC. Abbildung: Weber Lab, Universität Zürich)
 
Figure 6
Abbildung 6: Alle Axon-Laser bieten TPC-Funktionalität als Option in einem gemeinsamen Formfaktor.
 
Abbildung 7: Chameleon Discovery NX TPC in Zusammenarbeit mit Axon 920 TPC. TPC ermöglicht vereinfachte optische Layouts und spart wertvollen Platz auf dem Tisch. Foto mit freundlicher Genehmigung von Neil Merovitch, Hospital for Sick Children, Toronto.

Schlussfolgerungen

In dieser Technical Note haben wir die beiden führenden Ansätze zur Modulation der Laserausgangsleistung von Femtosekundenlasern, die in der Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet werden, diskutiert – die elektro-optische und die akusto-optische Modulation. Die meisten „Eigenbauer“ haben sich bisher für EOMs entschieden, weil es relativ einfach ist, dieses mit Hochspannung betriebene Gerät im optischen Pfad einzusetzen. Verschiedene Mikroskophersteller bieten entweder EOMs oder AOMs an, die teilweise in ihre Lasersysteme integriert sind, wobei ihre Softwarearchitektur sowohl das Mikroskop als auch den Laser steuert. Aufgrund seiner Erfahrung mit Hochleistungs-Faserlasern, die für Fertigungsumgebungen im Dauerbetrieb entwickelt wurden, erkannte Coherent, dass die Vorteile des AOM-Ansatzes in Bezug auf Größe, Kosten, Geschwindigkeit und Gesamtleistung auch für Anwendungen der Zwei-Photonen-Bildgebung geeignet sind. Durch die Integration der ausgefeilten Steuerung des AOM in die Laser-Software- und Hardware-Architektur von Discovery NX, Axon und Monaco profitieren Zwei-Photonen-Anwender – sowohl Eigenbauer als auch Endoskopie-Unternehmen – von einem stark vereinfachten und leichter zu steuernden optischen Aufbau für Anwendungen, die von fortgeschrittenen Neurowissenschaften bis hin zur medizinischen Diagnostik reichen.

Zitierte Werke

W. Denk, J.H. Strickler und WW Webb Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science – 1990. – pp. 73-76.

A.M Packer, D.S. Peterka, J.J. Hirtz, R. Prakash, K. Deisseroth und R. Yuste Two-photon optogenetics of dendritic spines and neural circuits. Nat Methods, 9 (12), 1205–1205, 2012. 

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