기사

이광자 현미경용
레이저 변조 솔루션

개요

1990년에 이광자 레이저 스캐닝 형광 현미경에 대한 획기적인 연구(Denk, et al., 1990)가 발표된 이후로 이 기술은 레이저 기술의 큰 변화로부터 이익을 얻었습니다. 이러한 개선 사항을 통해 초기에 물리학 실험실에서 세포 생물학, 질병 연구 및 고급 신경 과학 이미징에 이르기까지 기술 보급이 촉진되었습니다.

조정 가능한 원박스 티타늄 사파이어 레이저가 2001년경에 이러한 추세를 시작했습니다. 몇 년 후, 현미경의 샘플 평면에서 펄스 지속 시간을 최적화하기 위해 자동 분산 제어가 레이저에 추가되었습니다. 티타늄 사파이어 레이저의 상한선보다 긴 파장에서 여기 가능한 프로브의 성숙도와 효율성이 증가함에 따라 2010년 이후 레이저 회사들은 광 매개변수 발진기로 전환하여 색상 팔레트 증강, 이미징 심층화, 광손상 감소에 대한 요구를 해결했습니다.

이 기사에서는 이 진화의 다음 단계로 레이저 시스템에 고속 출력 변조를 통합하고 이를 통해 설정 시간을 단축하고 성능을 극대화하며 소유 비용을 낮추는 방법에 대해 설명합니다. 

이광자 현미경의 레이저 출력 제어에 대한 요구 사항.

가장 간단한 형태로 위상 지연 파장판과 편광 분석기를 추가하여 레이저 출력을 지속적으로 제어할 수 있습니다. 파장판의 회전에 의해 분석기를 통한 레이저 출력의 전송은 일반적으로 0.2% 전송에서 ~99%로 변경될 수 있습니다. 예를 들어 파장판을 전동화하면 이 공정을 자동화하여 현미경의 이미징 평면에서 전력을 변경하여 다른 깊이 프레임에서 집중된 플루언스를 균등화할 수 있습니다.

그러나 대부분의 최신 레이저 스캐닝 이광자 현미경에서는 더 빠른 변조 속도가 필요합니다. 예를 들어 데이터 수집이 한 방향으로만 이루어져야 하는 래스터 레이저 스캐닝 작업의 경우 원치 않는 형광자 여기 또는 광퇴색을 피하기 위해 "플라이백 작업" 중에 레이저를 블랭킹해야 합니다. 공진 검류계 스캐너의 경우 결과적인 상승/하강 시간은 몇 마이크로초 정도로 작을 수 있습니다. 이 영역에서 광 변조 방식을 고려해야 합니다. 

전기 광학 변조

EOM(전기 광학 변조기)은 포켈스 효과를 사용해 빔에 위상 지연을 적용하여 레이저 출력을 변조합니다. 여기서 전기장을 가해 비중심대칭 결정에서 복굴절이 유도됩니다. 이전과 마찬가지로 편광 분석기를 사용하여 변조기 설정을 완료합니다.

포켈스 셀은 상대적으로 짧은 결정을 가진 더 큰 빔을 수용하기 위해 세로 여기 기하 구조로 구성될 수 있습니다. 이 경우 일반적인 1⁄2 파장 전압(즉, 편광의 90도 회전에 필요한 전압)은 6kV 정도이며, 이는 2P 현미경에 필요한 속도와 듀티 사이클에서 달성하기 어렵습니다. 따라서 이미징을 위한 대부분의 구성에서는 더 긴 결정을 사용하여 반파장 전압을 크게 낮추는 가로 전기장 기하 구조를 채택합니다. 결정은 일반적으로 필요한 스위칭 전압을 더 낮추고 열 부하 효과를 보상하기 위해 서로에 대해 회전하는 2개 이상의 직렬 구성으로 배치됩니다.

최상의 이미지 대비를 위해 결정 정렬 및 오프셋(바이어스) 전압 조정을 통해 펄스 대비(최소 전송 전력 대 최대 전송 전력의 비율)를 최적화하도록 주의해야 합니다. 

포켈스 셀은 특히 인기 있는 이광자 파장에서 적당한 전력만 필요한 사용자에게 비교적 간단하게 배포되기 때문에 특히 "주택 건설업체" 커뮤니티에서 이광자 현미경에 널리 채택됩니다. 

예를 들어 인산중수소칼륨(KD*P) 기반 셀은 최대 약 1,100nm의 2P 응용 분야에 대해 우수한 투과율, 속도 및 대비 특성과 적당한 레이저 출력을 제공합니다. 또한 KD*P는 그룹 속도 분산 특성이 낮아 그룹 지연 분산(GDD)이 최소화됩니다. 이를 위해 KD*P 포켈스 셀은 티타늄 사파이어 레이저와 같이 분산 사전 보상 및 조정 제한 없이 초고속 레이저를 사용할 때 널리 사용되는 선택입니다. 

음향 광학 변조

AOM(음향 광학 변조기)은 압전 변환기가 부착된 투명한 결정 또는 유리로 구성됩니다. 변환기에 적용된 무선 주파수(RF) 파동은 결정을 변형시키는 음파를 유도하여 굴절률 격자를 생성합니다. 셀을 통과하는 빛은 브래그 회절을 겪습니다.

달성할 수 있는 상승/하강 시간은 음파가 레이저 빔을 가로지르는 데 걸리는 시간에 비례하므로 결정에서 빔의 폭을 줄여 최적화됩니다. 

분별도와 이에 따른 명암비는 0과 첫 번째 회절 차수 간의 분리각(θS)과 관심 작업 평면까지의 거리에 따라 정의됩니다.

이광자 현미경에 사용되는 가장 일반적인 AOM 재료는 이산화텔루륨(TeO2)입니다. 이 재료는 넓은 파장 범위에서 우수한 회절 효율과 고출력 처리를 보여 줍니다. 최대 전송 효율은 30dBm 정도의 적당한 RF 전력으로 달성됩니다.

TeO2 AOM은 일반적으로 1차로 최고의 회절 효율을 제공하는 브래그 상호 작용 영역에 구성되며, 더 높은 차수는 소멸됩니다. 최소 RF 전력 수준으로 고효율을 달성하려면 1cm가 넘는 결정 길이가 필요하므로 무시할 수 없는 그룹 지연 분산(GDD)이 발생합니다. AOM 기반 현미경 시스템은 다른 다운스트림 광학 장치, 특히 대물 렌즈의 분산도 고려하면 샘플 평면에서 가장 짧은 펄스를 유지하기 위해 분산 사전 보상이 장착된 레이저와 협력하여 이점을 얻을 수 있습니다.

가변 레이저용 AOM을 배치하려면 세심한 광학 및 제어 전자공학 설계가 모두 필요합니다. 분리각(θS)은 RF 구동 주파수(즉, 격자 주기)와 레이저 파장에 따라 달라지므로 레이저 파장을 조정할 때 포인팅 변경을 최소화하도록 RF 구동 주파수를 주의 깊게 보정해야 합니다. 또한 최대 회절 효율은 서로 다른 파장에 대해 서로 다른 RF 전력에서 달성됩니다. RF 주파수와 전력을 주의 깊게 제어하고 조정 가능한 이미징 시스템에서 상대적으로 큰 GVD를 관리해야 하기 때문에 더 많은 통합 작업이 필요하므로 뛰어난 성능 특성에도 불구하고 많은 주택 건설업체 및 맞춤형 설정에서 AOM 사용이 제한되었습니다. 

광범위하게 조정 가능한 레이저의 변조

680~1,300nm 정도로 2W를 초과하는 출력을 가진 광범위하게 조정 가능한 원박스 레이저가 출현함에 따라 레이저 변조를 위한 새로운 성능 체제와 통합 작업이 필요합니다.

일반적으로 사용되는 KD*P 포켈스 셀은 고출력에서 열 블루밍 효과를 나타내므로 빔 포인팅, 빔 웨이스트 무결성 및 수명에 해롭습니다. 더 긴 파장은 더 높은 구동 전압과 명암비 문제를 나타냅니다. 탄탈산 리튬은 광범위한 튜닝에 실행 가능한 EOM 재료이지만 상용 장치의 그룹 지연 분산은 보정 가능한 분산 보상 레이저 범위보다 높기 때문에 펄스가 길어지고 피크 출력이 감소하여 효율적인 이미징에 해를 끼칩니다.

앞서 설명한 바와 같이 AOM 기반 솔루션은 잠재적인 비용 및 성능 이점이 있음에도 불구하고 배포하는 데 높은 수준의 광학 설계 및 전자공학 제어 전문 지식이 필요하며, 이러한 전문 지식은 많은 생체 영상 시설에서 쉽게 사용할 수 없는 경우가 많습니다. 즉, AOM 솔루션은 일부 현미경 공급업체에서 통합 솔루션으로 상업적 이용이 가능합니다.

2017년에 Coherent는 사용자와 현미경 업계 모두 AOM 변조와 레이저 소스를 통합하는 턴키 솔루션으로 이점을 누릴 것임을 인식했습니다. Coherent는 산업용 초고속 가공 레이저의 통합 AOM 솔루션에서 얻은 전문 지식을 바탕으로 Chameleon Discovery 레이저를 위한 완전히 통합된 옵션으로 전체 출력 제어(TPC)를 개발했습니다.

Chameleon Discovery NX에서 사용할 수 있는 전체 출력 제어는 핸즈프리 자동화 패키지에서 660nm~1,320nm의 전체 옥타브 튜닝 범위에서 고대비(>1000:1) 및 고속(<1μs 상승 시간) 변조를 제공합니다. 

RF 주파수와 출력 보정 및 조정에 대한 모든 까다로운 요구 사항은 레이저에 내부적으로 프로그래밍되어 있으므로 사용자 또는 현미경 통합업체는 필요한 설정 파장과 출력 수준을 제공하기만 하면 됩니다.

AOM은 매우 비용 효율적이기 때문에 Chameleon Discovery NX TPC의 고정 파장 1,040nm 출력에는 자체 전용 AOM 및 드라이버도 장착되어 있습니다. 전원은 직렬/USB 명령 또는 고속 아날로그 제어 입력으로 편리하게 제어할 수 있습니다.

미래 트렌드

이광자 이미징 기술의 범위가 OEM 및 임상 전 응용 분야로 더욱 확대됨에 따라 단일 파장의 비용 효율적인 펨토초 소스에 대한 수요가 증가하고 있습니다. Axon 시리즈의 소형 초고속 소스는 이러한 요구 사항을 완벽하게 해결합니다.

제품 개념 단계에서 TPC 기능이 Axon 설계에 통합되어 새로운 현미경 설계 및 응용 분야에 간편하게 배포할 수 있었습니다. 이는 이광자 현미경 시스템이 순수한 연구 장비가 아닌 이동식 진단, 임상 또는 고처리량 검사 장치의 일부인 응용 분야에 최고의 통합 편의성을 제공합니다. 

첨단 신경과학 연구에서 고출력 레이저는 광유전학적 자극을 사용하여 전광 생체 내 이미징 기술에서 핵심적인 역할을 하고 있습니다(Yuste, 2012). 수십 와트의 레이저 출력은 공간 광 변조기(SLM)를 사용하여 수십 또는 수백 개의 뉴런을 개별적으로 처리할 수 있는 개별 빔렛으로 분할됩니다. 이 광학 제어 방법에는 짧고 맞춤 가능한 펄스 버스트가 필요합니다. Coherent Monaco와 같은 고출력 파이버 레이저는 전체 파이버 설계 형식 덕분에 이러한 응용 분야에서 요구하는 유연성을 제공합니다. 결과로 발생하는 높은 평균 출력, 높은 에너지 레이저 요구 사항 및 밀리초 미만의 시간 척도에서 자극 빔을 전환해야 하는 필요성은 기존 포켈스 셀 기술에 특정한 과제를 제시합니다. 이를 위해 AOM 기술이 Monaco에 완전히 통합되어 정교한 펄스 제어, 단순화된 현미경 설계 및 향상된 이미징 시스템 신뢰성을 제공합니다. 

결론

이 기술 노트에서 이광자 현미경에 사용되는 펨토초 레이저의 레이저 출력을 변조하는 두 가지 주요 접근 방식인 전기 광학 및 음향 광학 변조에 대해 설명했습니다. 대부분의 "주택 건설업체"는 광학 경로에 이 고전압 전원 장치를 배치하는 것이 상대적으로 간단하기 때문에 지금까지 EOM을 선택했습니다. 다양한 현미경 공급업체는 현미경과 레이저를 모두 제어하는 소프트웨어 아키텍처와 함께 레이저 전달 트레인에 부분적으로 통합된 EOM 또는 AOM을 제공합니다. Coherent는 연중무휴 24시간 제조 환경을 위해 설계된 고출력 파이버 레이저에 대한 제조 경험을 활용하여 크기, 비용, 속도 및 전체 성능과 관련된 AOM 접근 방식의 장점이 이광자 이미징 응용 분야도 충족할 수 있음을 인식했습니다. AOM의 정교한 제어를 Discovery NX, Axon 및 Monaco의 레이저 소프트웨어 및 하드웨어 아키텍처에 통합함으로써 이광자 사용자(주택 건설업체 및 스코프 회사 모두)는 고급 신경 과학에서 의료 진단에 이르는 응용 분야에서 훨씬 간단하고 쉽게 제어할 수 있는 광학 설정의 이점을 누릴 수 있습니다. 

인용 문헌

W. Denk, J.H. Strickler, and W.W. Webb Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science - 1990. - pp. 73-76.

A.M Packer, D.S. Peterka, J.J. Hirtz, R. Prakash, K. Deisseroth and R. Yuste Two-photon optogenetics of dendritic spines and neural circuits. Nat Methods, 9 (12), 1205-1205, 2012. 

Figure 1
그림 1: 간단히 표현한 횡방향 포켈스 셀 작동. 분석기를 통한 전송은 적용된 전기장의 조정에 의해 변조됩니다. 
그림 2: 이광자 현미경에서 일반적인 포켈스 셀 배치. EOM은 사용자의 오른손 바로 아래에 있습니다. 사진 제공: Packer Lab, 옥스퍼드 대학교. 영국. 
Acousto-Optic Modulation
Figure 3
그림 3: Chameleon Discovery NX TPC 및 변조 후 일반적인 최대 출력 전력
Figure 4
그림 4: 제공된 GUI를 사용하여 출력 전력을 직접 변경하거나 사용자가 플라이백 블랭킹 및 빠른 디더 제어를 위한 추가 고속 아날로그 입력을 제공할 수 있습니다. 
Figure 5
그림 5: Discovery TPC가 지원하는 고대비 및 빠른 프레임 속도의 칼슘 이미징의 예.
 
(1,100nm에서 여기된 RCaMP1.07을 발현하는 뉴런(빨간색)과 940nm에서 여기된 GCaMP6을 발현하는 성상세포(녹색)의 오버레이, 생체 내, 쥐. 여기 소스: Chameleon Discovery TPC. 그림 출처: Weber Lab, 취리히 대학교) 
Figure 6
그림 6: 모든 Axon 레이저는 공통 폼 팩터 내에서 TPC 기능을 옵션으로 제공합니다.
Figure 7
그림 7: Chameleon Discovery NX TPC는 Axon 920 TPC와 제휴했습니다. TPC는 광학 레이아웃을 단순화하고 귀중한 테이블 공간을 절약합니다. 사진 제공: Neil Merovitch, Hospital for Sick Children, 토론토.
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