Coherent Axon 780ファイバーレーザ搭載の2光子代謝FLIM

光子計数装置の技術リーダーであるBecker & Hickl GmbHは、小型フェムト秒ファイバーレーザがマルチフォトン蛍光イメージングシステムの安価な励起源として使用できることを以前に示しました。780 nmの発光波長、40 MHz～80 MHzのパルスレート、100 mW～500 mWの平均出力を持つレーザは、NAD(P)Hの励起だけでなく、非常に短い蛍光寿命 [3、4、5] を含むさまざまな他の発蛍光団 [1、2] にも適しています。

そのため、ベッカーとヒックルは、Axonフェムト秒ファイバーレーザがこれらの用途でどのように機能するかに興味を持っていました。

図1：Coherent Axon 780フェムト秒レーザ

 

システムアーキテクチャ

テストシステムとして、bh DCS-120 MPマルチフォトンFLIMシステムを使用しました。このシステムのアーキテクチャを図2に示します。 

Axon 780レーザのレーザレーザビームは、フリービームを介してDCS-120スキャンヘッドに注入されます。スキャンヘッド内では、2つの高速ガルバノメーターミラーによって偏向されます。スキャンヘッドのスキャンレンズは、レーザビームを顕微鏡に投影します。顕微鏡内では、ビームはダイクロイックビームスプリッターを通過し、顕微鏡レンズの背面開口部に投影されます。顕微鏡対物レンズは、試料内の画像面にビームを集束させます。ガルバノメーターによってビームが偏向すると、レーザフォーカスラスタースキャンがサンプル内の画像領域にミラーされます。

 

最大空間分解能を得るには、レーザビームが顕微鏡レンズの背面開口部を完全に満たすことが重要です。スキャンとチューブレンズの通常の焦点距離では、これは自動的には実現されません。したがって、ビームはスキャナに入る前に1.5倍に拡大されます。背面開口のビーム直径は約12  mmで、最大級の顕微鏡レンズの開口を満たすのに十分です。開口部の過充填は問題ありません。レーザは必要以上に多くの出力を供給するため、励起出力の損失は許容できます。

サンプルからの蛍光光は顕微鏡レンズを通して回収され、デカントされていないビーム経路を通して供給されます。L1とL2は、ペリスコープを形成します。また、顕微鏡レンズによって完全にコリメートされていない光子、例えば、厚いサンプルから出て行く途中で散乱される光子も収集します。蛍光光は2つの波長間隔に分割され、2つのbh HPM-100-40ハイブリッド検出器によって検出されます[6, 7]。検出器からの単光子パルスは、2つのSPC-180N TCSPC / FLIMモジュールに記録されます[1]。SPC-180Nモジュールは、励起パルス後の光子の検出時間と光子検出時のスキャナの位置を決定します。この情報は、FLIM画像の作成に使用されます。これらはピクセルのアレイで、各ピクセルには多数のタイムチャネルに完全な蛍光減衰曲線が含まれています[1]。

フライバックフェーズでのレーザビームのスキャンとビームブランキングは、bh GVD-140スキャンコントローラカードによってハードウェア制御されます。レーザ強度制御は、AxonレーザのAOM制御信号入力を介して行われます。この信号は、GVD-140カードからも提供されます。システム全体は、bhのSPCMデータ取得および制御ソフトウェア[1]によって動作し、スキャナ制御、レーザ制御、データ取得、およびデータ分析を備えた完全に統合されたFLIMシステムを提供します。FLIMシステムのユーザーインターフェースを図3に示します。

図3：SPCMデータ収集および制御ソフトウェアの主要パネル

 

結果

DCS-120-AXONの組み合わせで撮影したFLIM画像を図4～図6に示します。すべての画像に40x、NA= 1.3の油浸レンズを使用しました。データ解析は、bh SPCImage NG FLIMデータ解析スイートを用いて実施した。図4および図5は、平均（振幅加重）寿命と代謝インジケータa1の色分けされたFLIM画像を示しています。選択した画像パラメータ（tmまたはa1）のヒストグラムが右上に表示され、カーソル位置の減衰曲線が右下に表示されます。選択したスポットの減衰パラメータは右端に表示されます。

図4：ブタ皮膚、NADH画像、振幅加重による二重指数減衰の平均寿命

 

図5：高速減衰成分のブタ皮膚、NADH画像、振幅、a1。a1は代謝状態の指標です。

 

図6は酵母細胞を示す。発光フィルターは、440～470  nmを検出するために選択され、したがって、スペクトル範囲をNAD(P)Hの検出に制限しました。 470  nmの検出上限は非常に制限的であるように見える場合があります。ただし、FADおよびFMN蛍光の検出を避けるためには、470  nm未満に制限する必要があります。これらの化合物はNAD(P)Hとともに励起されますが、代謝状態への依存度は異なります。データは、SPCImage NGのMLEアルゴリズムによって分析され、画像の個々のピクセルに高精度の2倍指数減衰パラメータを提供します。図は、a1、高速減衰コンポーネントの振幅を示しています。これは、非結合型NAD(P)Hの量を表します。 結合/非結合比は代謝によって変化するため、a1は「代謝指標」とも呼ばれます。

 

ご覧のように、a1は細胞によって明らかに異なります。これは、代謝状態が細胞によって異なることを示しています。高いa1（青色で表示）は代謝がより解糖性であることを示します。低いa1（黄色）は酸化性が高いことを示します。

 

「Coherent Axon 780フェムト秒ファイバーレーザと、bhの精密スキャナ光学系、検出器、TCSPC / FLIMエレクトロニクス、データ分析ソフトウェアを組み合わせることで、生細胞や組織の代謝に関する正確な情報が得られることを実証しました」。内部AOMベースの強度制御により、レーザはbhのSPCM FLIM取得ソフトウェアにスムーズに統合されます。ビームストップ状況やスキャナフライバックフェーズでのビームブランキングと再現性のある強度制御により、試料を局所的な光損傷から保護します。DCS-120 MP / Axon 780の組み合わせは、すべて、使いやすい高解像度、高感度、2光子レーザスキャニングFLIM顕微鏡です。 

 

参考資料

1. W. Becker, The bh TCSPC Handbook. 第10版。Becker & Hickl GmbH (2023)、www.becker-hickl.com。 
2. W. Becker、C. Junghans、H. Netz、フェムト秒ファイバーレーザ付き2光子FLIM。アプリケーションノート、www.becker-hickl.com
3. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann, Two-Photon FLIM of Mushroom Sporesは、超高速減衰コンポーネントを明らかにしています。アプリケーションノート（2021年）、www.becker-hickl.com
4. W. Becker、A. Bergmann、C. Junghans、天然カロテノイドの超高速蛍光減衰。アプリケーションノート、www. becker-hickl.com (2022)
5. W. Becker, C. Junghans, V. Shcheslavskiy, High-Resolution Multiphoton FLIMは、人間の髪の超高速蛍光減衰を明らかにしています。アプリケーションノート、www. becker-hickl.com (2023)
6. レーザ走査顕微鏡におけるW. Becker、B. Su、K. Weisshart、O. Holub、FLIM、FCS検出：GaAsPハイブリッド検出器による効率の向上。Micr. Res. 技術 74, 804-811 (2011)
7. Becker & Hickl GmbH、ハイブリッド検出器およびMCP-PMTからのSub-20ps IRF幅。アプリケーションノート、www.becker-hickl.com