白皮书

用于双光子显微成像的
激光调制解决方案

综述

自从双光子荧光显微镜由登克等人于 1990 年提出以来,得益于激光技术的发展,双光子显微成像技术也日趋成熟。 这一从最初的物理实验室中开发的技术,发展到细胞生物学、疾病研究和神经科学成像领域。

2001年左右,一体化可调谐钛宝石激光器推出后,更加推动了双光子成像技术的发展。几年后,激光器中又增加了自动色散预补偿功能,以优化到达样品的激光脉宽。 随着有些荧光的激发波长,超出钛宝石激光器波长的上限,2010 年之后,激光器公司开始采用满足不同波长、更深成像和更少光损伤需求的光学参量振荡器。

在本文中,我们将讨论激光功率的快速调制方法,以及如何实现更快的实验设置、更好的性能和更低的使用成本。

激光调制
双光子显微成像

“在激光器中集成快速功率调制,可缩短实验时间、提高性能并降低使用成本。”

双光子显微成像中的激光功率控制要求

在最简单的显微系统中,可以通过添加相位延迟波片和偏振分析仪,来实现对激光功率的连续控制。 通过旋转波片,激光通过分析仪后的功率可以从 0.2% 到 99% 范围内调节。 例如,使用电动旋转波片,可以自动改变显微镜成像平面的功率,以均衡不同深度的光通量。

但现代的双光子激光显微镜需要更快的调制速度。 例如,当在单个方向上进行扫描、采集数据时,在回扫时消隐功率,避免产生荧光噪声信号或光漂白。 如果是共振振镜扫描仪,信号的上升/下降时间可能只有几微秒。 因此,这就需要一种快速功率调制的方法。

电光调制

电光调制器 (EOM) 利用普克尔斯效应,通过对光束施加相位延迟来调制激光功率。 在电光调制器中,通过施加电场,在非中心对称的晶体中诱发双折射。 EOM也包括偏振分析仪。

纵向设计的普克尔斯盒,可以在长度较短的晶体中实现大孔径的光束输出。 在这种情况下,典型的 ½ 半波电压(即偏振旋转 90 度所需的电压)约为 6 kV,这在双光子显微镜的速度和占空比下难以实现。 大多数双光子显微镜采用横向电场设计,使用更长的晶体,这会显著降低半波电压。 这种设计里面通常配置两块以上的晶体,位置可以相对旋转,以降低电压并补偿热负载效应。

通过晶体校准和偏移(偏置)电压调整来优化脉冲对比度,以获得优异的图像对比度。

电光调制 (EOM)
用于双光子显微成像的激光调制解决方案

图 1: 横向普克尔斯盒操作的示意图。 通过外加电场来调制激光的透射率。

普克尔斯盒由于设计比较简单,在双光子显微成像中得到了广泛应用,尤其适用于常见的激光波长,用户自己搭建的双光子系统。

例如,磷酸二氘钾 (KD*P) 普克尔盒可为 1100 nm 的 双光子成像 提供出色的透射率、速度和对比度特性,并提供适中的激光功率。 此外,KD*P 具有很低的群速度色散特性,从而显著减小群延迟色散 (GDD)。 对于没有色散预补偿以及波长调谐范围有限的超快激光器(例如钛宝石激光器),KD*P 普克尔斯盒是一种很好的选择。

激光调制解决方案

图 2: 双光子显微镜上的典型普克尔斯盒配置图。 EOM 位于用户右下方。 照片由英国牛津大学 Packer 实验室提供。

声光调制

声光调制器 (AOM) 包含一个透明晶体或玻璃,里面附有一个压电换能器。 施加到换能器的射频 (RF) 会诱发产生声波,使晶体介质密度呈现周期性变化,折射率也发生相应的周期性变化,这样声光介质在超声场的作用下,就变成了一个等效的相位光栅。 光经过晶体后会产生布拉格衍射。

光学上升/下降时间与声波穿过激光束时间成正比,因此可以通过减小晶体中的光束宽度来获得最快速度。

晶体中的零级和一级衍射间的角度(θS) 以及到工作平面的距离,决定了AOM的分辨率和对比度。

声光调制 (AOM)

“对于680-1300 nm 波长 2 W以上的一体化可调谐激光器,需要一种新型的激光调制方法。”

双光子显微成像中最常用的 AOM 材料是二氧化碲 (TeO2)。 这种材料在很宽的波长范围内具有出色的衍射效率和高功率处理能力。 使用 30 dBm 左右的 RF 可实现高透射效率。

TeO型2 AOM 通常配置在布拉格衍射相互作用区中,具有良好的一阶衍射效率,并忽略掉高阶衍射。 如果要以极低的射频功率实现高衍射效率,就需要长度大于 1 cm 的晶体,但同时也会产生明显的群延迟色散 (GDD)。 另外考虑到其他光学器件的色散,尤其是物镜,基于 AOM 的显微镜系统需要配备色散预补偿功能的激光器,以保持到达样品的短脉冲。

可调谐激光器的AOM 需要精确的光学和控制电子学设计。 由于衍射角 (θS) 取决于射频驱动频率(即光栅周期)和激光波长,因此必须精确校准射频驱动频率,以确保在调谐激光波长时光束的指向变化最小。 此外,还需要保证在不同射频功率、不同波长的情况下,能实现高衍射效率。 尽管 AOM 具有出色的性能,但由于需要精确控制射频频率和功率,并且还需要消除 GVD,因此显微系统的集成工作变得更加复杂,这也限制了AOM在用户自己搭建的双光子系统中的应用 。

可调谐激光器中的光束调制

对于680-1300 nm 波长 2 W以上的一体化可调谐激光器,需要一种新型的激光调制方法。

典型的 KD*P 普克尔斯盒在高功率下会有热晕效应,这对光束指向性、束腰质量和寿命都是有害的。 长波的激光波长会要求更高的驱动电压和对比度。 钽酸锂是一种常用的 EOM 材料,但商业的EOM群延迟色散太高,超出色散补偿可校正范围,从而产生长脉冲并降低峰值功率,不利于高效成像。

尽管具有AOM具有成本和性能优势,但它需要非常精确的光学和电子设计,用于集成到显微系统中,因此这也限制了AOM在自搭建的生物成像设备中的应用。 通常只有在商业化的显微镜系统里,AOM跟系统有更好的集成度。

2017 年,相干公司意识到,显微镜用户非常需要 AOM 与激光器集成在一起的一体化解决方案。 基于工业超快激光器集成 AOM 解决方案的经验,相干公司开发了全功率控制 (TPC),作为 Chameleon Discovery 激光器的AOM集成选配项。

Chameleon Discovery NX 提供全功率控制TPC,可在 660 nm 至 1320nm 的调谐范围内提供高对比度 (>1000:1) 和快速(上升时间 <1 μs)调制。

可调制的 Chameleon Discovery NX

图 3: Chameleon Discovery NX TPC 和调制后的典型最大输出功率。

激光器的内部程序,可以校准和调整射频频率和功率,用户只需要设置激光波长和功率即可。

Chameleon Discovery NX TPC 的固定波长 1040 nm 输出口,也配备了专用 的AOM 和驱动器。

可以通过串行/USB 命令或快速模拟控制输入,非常方便地控制功率输出。

图 4: 软件的用户界面上可以 直接控制功率大小,
用户也可以添加外部模拟信号输入,控制回扫功率消隐
和信号抖动。

内部程序来控制波长和功率

未来趋势

随着双光子成像技术在 OEM 和临床实验的发展,市场对经济高效的单波长飞秒激光的需求日益增长。 Axon 系列紧凑型超快激光器完全满足了这些要求。

Axon 配置了TPC功能 ,可以更容易地集成到显微镜的设计和应用中。 搭配Axon的便利性,使得双光子显微镜系统不仅仅是用于实验室研究的仪器,还可以应用于移动诊断、临床或高通量筛选。

在前沿的神经科学研究中,高功率激光器对于光遗传学刺激的活体成像技术中发挥着关键作用(Yuste,2012 年)。 数十瓦的激光通过空间光调制器 (SLM) 分解成很多条细光束,用来刺激数十或数百个神经元。 这种方法需要用到灵活性高的短脉冲激光器。 采用全光纤设计,相干公司 Monaco 高功率光纤激光器满足此类应用。 但Monaco的高平均功率、高激光能量以及在亚毫秒时间尺度上控制激光束的需求,普克尔斯盒技术很难实现。 因此,Monaco 集成了AOM技术,能够精准地控制激光脉冲、简化显微系统设计,并提高成像系统的可靠性。

高对比度的钙离子快速成像

图 5: Discovery TPC 支持的高对比度、高对比度的钙离子快速成像示例。 ( 小鼠活体内1100nm 激光激发的 红色RCaMP1.07 的神经元,以及 940nm 激光激发的绿色 GCaMP6s 的星形胶质细胞的重叠图。 使用 Chameleon Discovery TPC激光器。 苏黎世大学 Weber 实验室供图)。

Axon 激光器内置 TPC 功能

图 6: Axon 激光器具有TPC选配项。

 Chameleon Discovery NX TPC搭配 Axon 920 TPC。

图 7: Chameleon Discovery NX TPC搭配 Axon 920 TPC 激光器内置的TPC 可简化光学平台的配置,并节省平台空间。 照片由多伦多儿童医院 Neil Merovitch 提供。

总结

在本文中,我们讨论了双光子显微成像中飞秒激光器功率的两种调制方法:电光调制和声光调制。 目前,大多数用户自己搭建的系统选择使用 EOM,因为EOM集成起来相对比较简单。 而商业化生产的双光子显微镜内部集成 EOM 或 AOM 到激光传输系统中,使用软件同时控制显微镜和激光器。 相干公司基于生产高可靠性、高功率光纤激光器的制造经验,将 AOM 集成到激光器内部,减小了系统整体尺寸和成本,同时提高了速度和性能,更加适合双光子成像应用。 将 AOM集成到 Discovery NXAxonMonaco 激光器中,并通过软件控制,极大地简化了用户(自制系统和显微镜公司)对双光子显微系统的集成和使用,从神经科学研究到医学诊断,我们都有优异的解决方案。

如您有任何需求,请联系我们。