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레이저 변조 솔루션

2광자 현미경용

개요

1990년에 발표된 2광자 레이저 스캐닝 형광 현미경에 대한 획기적인 연구(Denk, et al., 1990) 이후로, 레이저 기술이 단계적으로 변화하면서 이 기술이 혜택을 누리게 되었습니다. 그리고 이러한 개선을 통해 초기에 물리 실험실부터 세포 생물학, 질병 연구, 진보된 신경과학 영상에 이르기까지 기술 보급의 촉진이 이루어졌습니다.

파장 가변의 원박스 티타늄 사파이어(Ti:Sapphire) 레이저에서는 2001년경부터 이러한 트렌트가 시작되었습니다. 그리고 몇 년 후에 현미경의 샘플 평면에서 펄스 지속 시간을 최적화하기 위해 자동 분산 제어가 레이저에 추가되었습니다. 티타늄 사파이어(Ti:Sapphire) 레이저의 상한보다 긴 파장에서 흥분할 수 있는 프로브가 더욱 성숙하고 효율적이 되면서 2010년 이후 레이저 회사들은 색상 팔레트를 증강시키고 보다 깊어진 이미징을 획득하면서도 광손상은 더욱 감소시키기 위해 광학 파라메트릭 오실레이터로 전환했습니다.

이번 기사에서는 이러한 진화의 다음 단계인 레이저 시스템의 빠른 전력 변조의 통합에 대해 알아보고, 이것이 어떻게 설정 시간을 더욱 빨라지게 하고 최고의 성능이 나타나게 하며 소유 비용을 낮추는지에 대해 논의해 보겠습니다.

레이저 변조
2광자 현미경

""레이저 시스템에 빠른 전력 변조를 통합함으로써 설정 시간이 단축되고 최고의 성능을 갖추게 되며 소유 비용이 절감됩니다."

2광자현미경에서의 레이저 출력제어 요구사항

가장 간단한 형태로 위상 지연 파장판과 편광 분석기를 추가하여 레이저 출력을 지속적으로 제어할 수 있습니다. 파장판이 회전하면 분석기를 통한 레이저 전력 전송은 보통 0.2%에서 99%까지 변경될 수 있습니다. 예를 들면, 파장판의 전동화를 통해 이 프로세스가 자동화되면 현미경의 이미징 평면에서 전력이 변경되어 다른 깊이의 프레임에서 집중된 영향이 균등화될 수 있습니다.

그러나 최신 레이저 스캐닝 2광자 현미경 대부분은 더욱 빠른 변조 속도가 필요합니다. 예를 들면, 한 방향으로만 데이터를 수집해야 하는 래스터 레이저 스캐닝 응용 분야의 경우에는 레이저가 원치 않는 형광 여기(excitation)나 광 표백을 방지하기 위해 "플라이백 작업" 중에 블랭킹해야 합니다. 공진 갈바노미터(galvanometer) 스캐너의 경우 상승 시간이나 하강 시간은 몇 마이크로초만큼 작을 수 있습니다. 이 영역에서 광 변조 방식을 고려해야 합니다.

전기-광학 변조

전기 광학 변조기(EOM)은 포켈 효과를 통해 위상 지연을 빔에 적용하여 레이저 전력을 변조합니다. 이 곳이 전기장의 인가에 의해 비중심 대칭 결정에서 복굴절이 유도되는 지점입니다. 이전과 마찬가지로 편광 분석기를 사용하여 모듈레이터 설정을 완료합니다.

포켈 셀은 상대적으로 짧은 결정을 통해 더 큰 빔을 수용하도록 세로 여기 형상( longitudinal excitation geometry)에서 구성될 수 있습니다. 이 경우 일반적인 반파장 전압(즉, 편광의 90도 회전에 필요한 전압)은 6kV 정도이며, 이는 2P 현미경의 속도 및 듀티 사이클에서 달성되기 어렵습니다 따라서 이미징을 위한 대부분의 구성은 더 긴 결정체를 사용하여 횡단 전계 형상을 채택하여 반파 전압을 크게 낮춥니다. 결정은 일반적으로 필요한 스위칭 전압을 더 낮추고 열부하 효과를 보상하기 위해 서로에 대해 회전하는 2개 이상의 직렬 구성으로 배치됩니다.

최고의 이미지 대조비를 획득하기 위해서는 결정 정렬과 오프셋(바이어스) 전압 조정을 통해 펄스 대조비(최소 전송 전력 대 최대 전송 전력의 비율)를 최적화하도록 주의를 기울여야 합니다.

전자 광학 변조(EOM)
2광자 현미경을 위한 레이저 변조 솔루션

그림 1: 횡단 포켈 셀 작업의 단순화된 표현 분석기를 통한 전송은 인가된 전기장을 조정해서 변조합니다.

포켈 셀은 2광자 현미경 검사에서 광범위하게 채택되고 있으며, 특히 인기 있는 2광자 파장에서 적당한 파워만 요구하는 사용자에 대해서 이러한 포켈 셀이 비교적 단순하게 배치되어 있으므로 "홈빌더" 커뮤니티에서 특히 많이 채택되고 있습니다.

예를 들어, 인산수소칼륨(KD*P)을 기반으로 하는 셀은 약 1100nm까지에 대한 2P 응용 분야와 적당한 레이저 출력까지에 대해 우수한 투과율, 속도, 대조비 특성을 제공합니다. 또한 KD*P는 그룹 속도 분산 특성이 낮아 그룹 지연 분산(GDD)이 최소화됩니다. 이를 위해 KD*P 포켈 셀은 티타늄 사파이어(Ti:Sapphire) 레이저와 같이 분산 사전 보정과 제한된 튜닝 없이 초고속 레이저를 사용할 때 자주 채택됩니다.

레이저 변조 솔루션

그림 2: 2광자 현미경에서의 일반적인 Pockels 세포 배치 EOM은 사용자의 오른쪽 바로 아래에 있습니다. 사진제공: 영국 옥스퍼드 대학교 패커 랩

음향 광학 변조

음향 광학 변조기(AOM)는 압전 변환기가 부착된 투명한 결정이나 유리로 구성됩니다. 변환기에 적용된 무선 주파수(RF) 파동은 결정을 변형시키는 음향파를 유도하여 굴절률 격자를 발생시킵니다. 셀을 통과하는 빛은 브래그 회절을 겪습니다.

달성 가능한 상승 시간이나 하강 시간은 음향파가 레이저 빔을 가로지르는 데 걸리는 시간에 비례하므로, 결정에서 빔의 폭을 줄여서 최적화됩니다.

식별과 이에 따른 대조비는 0차 회절 차수와 1차 회절 차수 사이의 분리 각도(θS)와 관심 작업 평면까지의 거리에 따라 정의됩니다.

음향 광학 변조기(AOM)

"파장 영역대가 680-1300nm이고 출력이 2W를 초과하며 광범위하게 조정 가능한 "원박스 레이저가 등장하면서 레이저 변조를 위한 새로운 성능 체제와 통합 노력이 필요해졌습니다."

2광자 현미경에 사용되는 가장 흔하게 사용되는 음향 광학 변조기(AOM) 물질은 이산화 텔루르이며(TeO2), 이 물질은 넓은 파장 영역에서 우수한 회절 효율과 고전력 처리를 나타냅니다. 최대 전송 효율은 30dBm 정도의 적당한 RF 전력을 제공하면 획득 가능합니다.

TeO2 음향 광학 변조기(AOM)는 흔히 첫번째 차수에서 최고의 회절 효율을 제공하는 브래그 상호 작용 방식으로 구성되며 더 높은 차수는 파괴적으로 소멸됩니다. Note that to achieve high efficiency with minimal RF power levels, crystal lengths of >1 cm are needed, resulting in non-negligible group delay dispersion (GDD). 다른 다운스트림 광학 장치, 특히 대물 렌즈의 분산도 고려하면 음향 광학 변조기(AOM) 기반 현미경 시스템은 샘플 평면에서 가장 짧은 펄스를 유지하기 위해 분산 사전 보정이 장착된 레이저와 함께 작동하게 되어 이점을 얻게 됩니다.

음향 광학 변조기(AOM)를 배치하려면 광학 설계와 제어 전자 설계를 주의 깊게 수행해야 합니다. 분리 각도(θS)는 RF 구동 주파수(예: 격자 주기)와 레이저 파장에 따라 달라지므로 레이저 파장을 조정할 때 포인팅 변경이 최소화되도록 RF 구동 주파수 보정을 신중하게 수행해야 합니다. 또한, 최대 회절 효율은 서로 다른 파장에 대해 서로 다른 RF 전력에서 달성됩니다. RF 주파수와 전력을 주의 깊게 제어하고 조정이 가능한 이미징 시스템에서 상대적으로 큰 GVD를 관리해야 하는 필요성이 대두됨에 따라 더욱 많은 통합 노력이 요구되었습니다. 그로 인해 음향 광학 변조기(AOM)는 그 성능 특성이 뛰어남에도 지금까지 홈빌더 및 맞춤형 설정에서 사용이 제한 되었습니다.

광범위하게 조정 가능한 레이저의 변조

680-1300nm의 파장 영역의 차수와 2W를 초과하는 출력을 가진 원박스의 광범위하게 조정 가능한 레이저가 등장하게 되면서 레이저 변조를 위한 새로운 성능과 통합 노력이 요구됩니다.

흔히 사용하는 KD*P 포켈 셀은 고출력에서 열 블루밍 효과를 나타내어서 빔 포인팅, 빔 웨이스트 무결성과 수명에 해로운 영향을 끼칩니다. 파장이 더 길어지면 구동 전압이 더 높아지고 대조비 문제도 더욱 커집니다. 탄탈산리튬은 광범위한 범위에 튜닝을 하기 위해 사용할 수 있는 EOM 재료이지만, 상용 장치의 그룹 지연 분산이 분산 보상이 이루어진 레이저의 보정 가능한 범위보다 높기 때문에 펄스가 더욱 길어지게 되고 피크 출력이 감소하게 되어 효율적인 이미지에 해로운 영향을 주게 됩니다.

앞에서 언급했던 것과 같이 잠재적 비용적 측면과 성능면에서 장점이 있음에도 음향 광학 변조기(AOM) 기반 솔루션은 배치를 위해 높은 수준의 광학 설계와 전자 제어 전문 지식이 있어야 하며, 바이오 이미징 시설에서 쉽게 사용하기 어려운 경우가 많습니다. 즉, 음향 광학 변조기(AOM) 솔루션은 일부 현미경 공급업체에서는 통합 솔루션으로 상업적으로 이용될 수 있습니다.

2017년에 코히런트는 사용자와 현미경 업계 모두가 음향 광학 변조기(AOM) 변조와 레이저 소스를 통합하는 턴키 솔루션의 혜택을 누릴 수 있다는 것을 알게 되었습니다. 코히런트는 산업용 초고속 머시닝 레이저의 통합 음향 광학 변조기(AOM) 솔루션에서 얻은 전문 지식을 바탕으로 카멜레온 디스커버리 레이저를 위한 완전히 통합된 옵션으로 토탈 전력 제어(Total Power Control)를 개발했습니다.

카멜레온 디스커버리 NX에서 사용 가능한 토탈 파워 컨트롤은 핸즈프리 자동 패키지에서 660nm~1320nm 범위의 전체 옥타브 튜닝 영역에 걸쳐 높은 대조비(>1000:1)와 빠른 변조 속도(상승 시간 미만)를 제공합니다.

변조 후 카멜레온 디스커버리 NX

그림 3: 카멜레온 디스커버리 NX TPC 및 변조 후 일반적인 최대 출력 전력

RF 주파수, 전력 보정, 조정에 대한 모든 까다로운 요구 사항은 레이저에 내부적으로 프로그래밍되어 있으므로 사용자나 현미경 통합업체가 제공해야 하는 것은 설정된 파장과 전력 수준뿐입니다.

AOM은 매우 비용이 저렴하므로 카멜레온 디스커버리 NX TPC의 고정 파장 1040 nm 출력도 자체 전용 AOM과 드라이버가 장착되어 있습니다.

전원은 직렬/USB 명령이나 빠른 아날로그 제어 입력으로 편리하게 제어할 수 있습니다.

그림 4: 제공된 GUI를 통해 출력 전력을 직접 변경할 수 있거나
사용자가 플라이백 블랭킹
및 고속 디저 제어를 위한 추가 고속 아날로그 입력을 제공할 수 있습니다.

내부 프로그래밍된 파장 및 전력 레벨

향후 트렌드

2광자 이미징 기술이 OEM과 사전 임상 응용 분야에도 폭넓게 적용되면서 단일 파장과 비용이 저렴한 펨토초 소스에 대한 수요가 증가하고 있습니다. Axon 시리즈의 소형 초고속 소스는 이러한 요구 사항을 완벽하게 해결합니다.

제품 개념 단계에서부터 Axon 설계에 TPC 기능이 통합되어 새로운 현미경 설계 및 응용 분야에 대한 배치가 단순화되었습니다. 이를 통해 2광자 현미경 시스템이 순수 연구 장비가 아닌 이동식 진단 장치, 임상 장치, 고처리량 스크리닝 장치의 일부인 응용 분야에 대하여 최상의 통합 편의성을 가져오게 된 것입니다.

최첨단 신경과학 연구에서 고출력 레이저가 광유전학적 자극을 이용한 전광학적 생체내 이미징 기술에서 핵심적인 역할을 하고 있습니다(Yuste, 2012). 수십 와트의 레이저 전력이 공간 광 변조기(SLM)를 통해 수십 개나 수백 개의 뉴런을 개별적으로 처리할 수 있는 개별 빔렛으로 분할됩니다. 이 광학 제어 방법에는 짧고 조정 가능한 펄스 버스트가 필요합니다. 코히런트 모나코와 같은 고출력 광섬유 레이저는 모든 광섬유 설계 형식 덕택에 이러한 응용 분야에서 요구하는 유연성을 제공합니다. 그 결과 발생하는 높은 평균 전력, 높은 에너지 레이저 요구 사항, 밀리초 미만의 시간 척도로 자극 빔을 전환해야 하는 필요성이 현재 포켈 셀 기술에 대한 특정 과제를 제시하게 됩니다. 이를 성취할 목적으로 AOM 기술이 정교한 펄스 제어, 단순화된 현미경 설계 및 향상된 이미징 시스템 신뢰성을 위해 Monaco에 완전하게 통합되었습니다.

높은 대조비, 빠른 프레임 속도 칼슘 이미징

그림 5: 디스커버리 TPC에 의해 활성화된 높은 대조비, 빠른 프레임 속도 칼슘 이미징의 예 생체 내 마우스에서 1100nm(빨간색)에서 흥분된 RCaMP1.07을 발현하는 뉴런과 940nm(녹색)에서 흥분된 GCaMP6을 발현하는 성상교세포의 오버레이 흥분 소스 카멜레온 디스커버리 TPC 취리히 대학교 베버 연구소의 피겨 크레딧

Axon 레이저는 TPC 기능을 제공합니다.

그림 6: 모든 Axon 레이저는 공통 폼 팩터 내에서 옵션으로 TPC 기능을 제공합니다.

카멜레온 Discovery NX TPC와 Axon 920 TPC가 함께 제공됩니다.

그림 7: 카멜레온 디스커버리 NX TPC는 Axon 920 TPC와 파트너쉽을 체결하였습니다. TPC를 통해 광학 레이아웃을 간소화하고 귀중한 테이블 공간을 절약할 수 있습니다. 토론토의 아동 전문 병원(Hospital for Sick Children)의 사용 허가를 받은 사진

요약

이번 기술 자료에서는 2광자 현미경에 사용되는 펨토초 레이저의 레이저 출력을 변조하는 두 가지 독보적인 접근 방식인 전기 광학 및 음향 광학 변조에 대해 알아보았습니다. 광학 경로에 이 고전압 전원 장치를 배치하는 것이 상대적으로 간단하기에 대부분의 "홈 빌더"는 지금까지 EOM을 선택했습니다. 다양한 현미경 공급업체는 레이저 전달 트레인에 부분적으로 통합된 EOM 또는 AOM을 제공하며, 소프트웨어 아키텍처는 현미경과 레이저를 모두 제어합니다. 코히런트는 24/7 제조 환경을 위해 설계된 고출력 광섬유 레이저 제조 경험을 바탕으로 크기, 비용, 속도, 전체 성능면에서 AOM 접근 방식의 장점이 2광자 이미징 응용 분야도 충족시킬 수 있음을 깨달았습니다. Discovery NX , AxonMonaco의 레이저 소프트웨어 및 하드웨어 아키텍처 내에서 음향 광 변조기(AOM)를 정교하게 제어한 것을 통합하게 되면 2광자 사용자(홈빌더 및 스코프 회사 모두)는 첨단 신경 과학에서 의료 진단에 이르기까지의 응용 분야에 대해 훨씬 간단하게 광학 설정을 할 수 있을 뿐 아니라 쉽게 제어도 할 수 있다는 장점을 얻게 됩니다.

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