了解用于双光子和三光子激发的激光源

双光子和三光子激发的好处

双光子激发是一种完善的三维成像工具，现在广泛应用于生命科学领域，尤其是神经科学领域。 超快（通常是飞秒）激光聚焦成小束腰。 在这个位置（也只有这个位置）上的高峰值强度，能够驱动荧光染料、蛋白质和内源性材料的双光子激发。 通过对这个激光点进行 xyz 坐标扫描，可以建立一个二维图像切片或三维图像立方体，具有高信噪比，而对活体组织的热影响最小。

为了对大脑皮层进行更深的神经元成像，三光子激发在神经科学界越来越受欢迎。 根据散射和吸收特性，大多数组织都会提供几个高穿透深度的特征波长窗口。 更高阶的非线性激发还会在组织样本中产生尺寸更小、强度更高的焦点，从而产生几乎没有离焦荧光背景的清晰图像。 与双光子技术相比，三光子激发的这些固有特性将功能性体内成像深度提高了一倍。  

双光子和三光子激发在脉冲能量、波长、重复频率和脉冲宽度方面均有独特的激光要求。 因此，基本的双光子和三光子实验技术不能由同一光源解决。 本白皮书旨在深入探讨这些特定的激光要求，重点介绍它们如何实现这种类型的激发，并介绍Coherent在简化双光子和三光子应用方面的相应激光开发。

双光子显微成像的激光要求

生物样本的双光子激发需要短脉冲、能够快速光栅成像的高重复频率、适合样本生活力的平均功率以及与多种不同可用探针的激发光谱相匹配的波长。 之所以对脉冲持续时间（脉冲宽度）有要求，是因为双光子激发概率很低，需要非常高的峰值功率。 通常使用的脉冲宽度在 75 到 250 fs 之间，其中较短的脉冲会导致更有效的激发，但出现非线性损伤甚至发生烧蚀损伤的风险更高。

只能通过在锁模机制下操作激光器来产生如此短的脉冲。 大多数锁模激光器以 50-100 MHz 的固定重复频率运行，这非常适合许多成像研究。 例如，假设一个典型的图像大小为 512 x 512 像素，帧速率为几赫兹。 在每个像素中需要有多个激发脉冲以减少噪声以及光栅扫描的开销，这就需要重复频率超过 10 MHz。更快的共振扫描实验需要重复频率达到数十兆赫。 

最常用的指示剂在波长 400 到 550 纳米（紫光到绿光）之间的单光子机制下激发。 在双光子状态下，这大致对应于 750 nm 到 1100 nm（近红外）之间的波长，恰好与基于钛宝石活性介质的可调谐激光器完美匹配。

表 1： 多光子激发优化激光参数总结。

最后，许多研究表明，大多数样本在这些近红外波长下能够耐受平均 100-200 mW 的激光功率，这样的功率与当今各种成像和功能性荧光探针相配合，足以提供明亮的图像。 一些显微镜的通量低至 10%，这意味着需要 1-2 瓦的激光功率。

如表 1 所述，一体化全自动可调谐钛宝石 (Ti:S) 激光器（例如Coherent Chameleon 系列）很好地满足了这些要求。 据估计，全球各地的实验室中总共有超过 5,000 台此类钛宝石激光器用于双光子显微成像。

三光子显微镜的激光源要求

与双光子显微成像相比，三光子显微镜仍处于相对初级阶段。 但由于它为更深层次成像提供了一些优势（例如在神经科学方面），其使用量正在相当迅速地增长。

三光子事件发生的概率要低得多，这就决定了需要比双光子激发高得多的峰值功率： 高出约 100-200 倍。 通过使用脉冲宽度较小和/或脉冲能量较高的激光器，可以实现更高的峰值功率。 然而，当通过显微镜系统传输最短的可用锁模脉冲（例如 10 fs）时，色散管理（避免畸变和展宽的脉冲）就成了问题。 因此，使用 40-60 fs 脉冲进行三光子激发，在高峰值功率和合理简单的脉冲管理之间实现了很好的平衡。 

这个脉冲持续时间大约只有双光子激光器典型脉冲持续时间的三分之一，这意味着与这些激光器相比，我们仍然需要将脉冲能量提高 40-50 倍。 虽然双光子显微成像激光器的输出脉冲能量在 10-40 nJ 范围内，但具有类似光学损耗的三光子显微镜需要 0.5-2 mJ 的激光输出。

达到此脉冲能量的一种方法是，使用啁啾脉冲放大 (CPA) 技术放大钛宝石激光器的输出。 CPA 技术由 Gerard Mourou 和 Donna Strickland 在二十世纪九十年代发明；这一技术具有重大意义，得到了极为广泛使用，因此他们获得了 2018 年诺贝尔物理学奖。

镱是功率缩放的关键

那么重复频率和平均功率呢？ 这里主要考虑的是样本活力。 根据大量双光子研究的成果可以确定，样本承受的平均功率应保持在 200 mW 以下，以保持样本的活力。 在上一部分中，我们指出三光子成像所需的每个脉冲能量应比双光子激发高 40-50 倍。 这意味着重复频率将不得不相应降低 — 比如 1-2MHz。为了提高成像速度，重复频率可以提高到 4-5 MHz，但前提是样本上每个脉冲的能量要相应减少。

遗憾的是，由于钛宝石晶体的物理特性，这种激光器是无法实现的。而另一方面，基于掺镱光纤的激光系统可以绕过这些问题。 这是因为使用掺镱有源光纤可以在更长的距离上对脉冲进行放大（光纤可以盘绕以形成紧凑的配置），在钛宝石放大器无法实现的高重复频率下也能提供足够的增益。

图 1 通过示意图说明了这类掺镱光纤放大器的典型结构。 与使用钛宝石激光器放大器一样，第一级（种子激光器 + 前置放大器）产生几十兆赫的锁模脉冲流。声光调制器 (AOM) 对这一脉冲串进行门控，并将重复频率降低一个整数 N。参考图中所示，如果 N=50，1 MHz 的脉冲串将在功率放大阶段由 CPA 放大。

这种架构非常灵活且功率可扩展；它可以很容易地产生高达 60 瓦甚至更高的平均功率，支持 1-50 MHz 的任何重复频率。为了避免光纤损坏，每个脉冲的能量受到限制，通常保持在每个脉冲 100 mJ 以下。

基于 CPA 的掺镱激光器在 1030-1070 nm 的固定波长下工作，而其增益带宽可以支持 ~250 fs 的脉冲。 波长或脉冲持续时间都不直接与三光子显微镜兼容，因此需要额外的脉冲处理，我们将在下一部分进行讲述。 顺便说一下，这些掺镱激光器在红移视蛋白的双光子光遗传学研究中得到了非常普遍的使用（即在掺镱激光器波长下激发）。在这种应用中，激光器的高输出功率可以通过空间光调制器“分散”在许多神经元上。

三光子激发的波长要求

对于三光子显微镜，激发基于绿色荧光蛋白的探针所需的波长约为 1300 nm；对于红移探针，约为 1700 nm。 在这两种波长机制中，1300 nm 被证明是更有益的三光子成像“窗口”，这一点稍后将在本白皮书中进行阐述。此外，高效三光子激发还需要 40-60 fs 的脉冲宽度。 那么我们如何使用掺镱激光器获得这种性能呢？

转换波长和脉冲宽度以满足三光子显微镜要求的最常用方法是使用波长可调光学参量放大器 (OPA)。 该设备将泵浦波长（来自掺镱激光器）转换为两个更长的波长，其光子能量之和等于泵浦光的光子能量。这种能量守恒可以表示为：

                          1/λp=1/λs+1/λi

其中 λ 表示波长，p、s 和 I 表示“泵浦”波长以及 OPA 产生的两个波长，通常称为“信号”波长和“闲频”波长。 由于历史原因，闲频波长始终是两个波长中较短的一个。

图 2 通过示意图说明了 OPA 如何生成三光子显微镜所需的波长。 掺镱激光器输出的一小部分用于在薄板上产生宽带“白光连续谱”。 然后，白光在非线性晶体中放大。该非线性晶体适用于用户选择的特定波长参数放大。 掺镱激光器输出的其余部分通过倍频产生 515- 520 nm 的绿光，这是 OPA 的“泵浦”波长。通过这种配置，OPA 可以产生 1300 nm 的闲频波长，这与流行的“绿光”探针的三光子激发相匹配。 能量守恒要求信号波长为 860 nm。

考虑到连续谱的白光性质，OPA 用户如何选择两个输出波长？ 这是通过相位匹配实现的，即调整晶体光轴和泵浦光束之间的角度。 通过倾斜晶体，可以选择放大白光中的哪一对波长。 可调谐 OPA 具有手动或电动和计算机控制的平台，以简化信号波长选择过程。

匹配脉冲宽度要求

与三光子显微镜同样重要的是，OPA 的特殊设计能够产生比泵浦脉冲短得多的脉冲。 具体来说，通过使用“非共线”设计，泵浦光束和信号光束在 OPA 晶体中以不同的角度传播，可以产生短至 20-25 fs 的脉冲。这种非共线方法在调谐范围内留下约 300 nm 的间隙，通常在 940 和 1250 nm 之间。 幸运的是，该区域与三光子激发无关。

由于涉及非线性过程（掺镱激光器的倍频和参数产生），整个系统的效率相对较低。 这就是掺镱激光器功率缩放的价值所在。 Coherent Monaco 等功率强大的掺镱激光器每脉冲可提供几十微焦能量。 这将在 1300 或 1700 nm OPA 中产生几微焦的脉冲，这与三光子激发的光学“窗口”相匹配。 图 3 显示了在 1 MHz 和 4 MHz 泵浦功率 60 瓦的 OPA（Coherent Opera-F）的典型调谐曲线，许多研究小组使用了此设置。

同时多探针成像

在前面的部分中，我们提到了 1300nm 是激发三光子模态重要探针的关键波长，如绿色荧光蛋白和基因编码钙指示器的 GCaMP 家族，其中 3 个光子携带的能量与 920nm 波长下 2 个光子携带的能量相同。 与之类似，在 ~1050 nm 波长下使用双光子激发的所谓“红移”探针，也可以在 1600- 1700 nm 波长上以三光子模态激发。 这些探针包括 m-Fruit 形态探针和 RCaMP 钙探针 — 另请参见图 4 

虽然绝大多数的三光子工作都是在 1300nm 波长上进行的，但红移探针理论上在 1600- 1700 nm 的较长波长上仍然可以激发，因此这仍是显微镜行业重点关注的方向。 这似乎表明，在双色激发成像中，理想的三光子激光器应该能够产生两种波长，甚至可能同时产生两种波长。 由于组织散射较低，较长的波长有可能进行更深层次的成像。当然，1700 nm 波长水吸收率高于 1300 nm 的水吸收率，这意味着样本发生热损坏的概率更高。

然而，几项已发表的研究表明，1300 nm 波长可用于激发绿色和红色荧光探针，或至少激发其中一部分。 然后用波长选择滤光片，可以很轻松地将两个探针的荧光发射分开。 例如，在 2021 年，Chris Xu 发表了一篇关于多色荧光团单波长三光子激发的文章（Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain | Science Advances），具有里程碑意义。 

最近，Timo van Kerkoerle 和他的博士生 Marie Guillemant 通过将Coherent Monaco 和 Opera-F 调谐到 1300 nm 完成三光子激发，完成了对小鼠前额叶皮层中，用葡聚糖和 tdTomato（一种红移探针）标记的小鼠中间神经元的同步激发（图 5）。 图 4 中的 z 堆栈图像显示了来自红移探头的显著信号，深度约为 1 mm。

这种方法不仅不需要两个 OPA，也不需要具有波长调谐功能的 OPA。 为了使这种多探针方法更容易实现，Coherent推出了一种一体化固定波长 1300 nm 飞秒脉冲光源，即Coherent Monaco 1300。 这种紧凑型光源是一种完全集成的全自动激光器，输出功率高达 2.5W，可选择 1、2 或 4MHz 的重复频率，脉冲宽度小于 50fs。 所有这些参数都非常适合深层次三光子成像，因此Coherent Monaco 1300 是第一款专门针对三光子显微镜的一体化成套光源。 

Coherent察觉到了三光子成像技术的兴起和日益普及，因此在设计 Monaco 1300 时考虑到了用户效益，将其设计成了可用于双光子显微成像的先进激光器的组成部分，例如Coherent Chameleon Discovery 和 Axon。 事实上，Coherent Monaco 1300 的全套功能包括提供即时功率衰减/选通的全功率控制 (TPC) 选项，以及提供色散预补偿以优化样本脉冲宽度的紧凑型脉冲压缩器 (CPC) 选项，而且后者可与任何类型的显微镜设置配合使用。