이광자 및 삼광자 여기를 위한 레이저 소스의 이해

이광자 및 삼광자 여기의 이점

이광자 여기(two-photon excitation)는 현재 생명과학, 특히 신경과학 분야에서 널리 사용되는 3차원 이미징을 위한 잘 정립된 도구입니다. Ultrafast(일반적으로 펨토초) 레이저는 작은 빔 웨이스트에 집중됩니다. 이 위치의 높은 피크 강도는 오직 이 위치에서만 형광자 염료, 단백질 및 내인성 물질의 이광자 여기를 유도할 수 있습니다. xyz에서 이 레이저 스팟을 스캔하면 높은 신호 대 소음비와 살아있는 조직에 미치는 열 영향을 최소화하면서 2차원 이미지 슬라이스 또는 3차원 이미지 큐브를 구축할 수 있습니다.

피질 내에서 더 깊은 뉴런 매핑을 추구하면서 삼광자 여기가 신경과학계에서 주목을 받았습니다. 대부분 조직의 산란 및 흡수 특성은 관심 파장에서 높은 침투 깊이의 여러 창을 제공합니다. 또한 고차 비선형 여기는 조직 샘플에서 더 높은 강도의 제한된 초점을 생성하여 초점이 맞지 않는 형광자 배경이 거의 없는 깨끗한 이미지를 생성합니다. 삼광자 여기의 이러한 고유한 특성은 이광자 기술에 비해 기능적인 생체 내 이미징 깊이를 두 배로 증가시킵니다.  

이광자 및 삼광자 여기에는 각각 펄스 에너지, 파장, 반복률 및 펄스 폭 측면에서 고유한 레이저 요구 사항을 가지고 있습니다. 따라서 기본적인 이광자 및 삼광자 실험 기술은 동일한 광원으로 해결될 수 없습니다. 이 백서의 목표는 이러한 특정 레이저 요구 사항을 심층적으로 탐구하여 각 유형의 여기를 활성화하는 방법을 강조하고 이광자 및 삼광자 응용 분야를 모두 간소화하는 Coherent의 해당 레이저 개발을 제시하는 것입니다.

이광자 현미경 검사를 위한 레이저 요구 사항

생물학적 샘플의 이광자 여기에는 짧은 펄스, 빠른 래스터 이미징을 위한 높은 반복률, 샘플 생존 가능성과 호환되는 평균 출력 및 사용 가능한 다양한 프로브의 여기 스펙트럼과 일치하는 파장이 필요합니다. 펄스 지속 시간(펄스 폭) 요구 사항은 이광자 여기의 가능성이 낮아 매우 높은 피크 전력이 필요하기 때문에 발생합니다. 일반적으로 사용되는 펄스 지속 시간은 75~250fs 사이이며, 펄스가 짧을수록 여기가 더 효율적이지만 비선형 샘플이나 절제 손상의 위험이 더 높습니다.

이러한 짧은 펄스는 모드 잠금 상태에서 레이저를 작동해야만 생성될 수 있습니다. 대부분의 모드 잠금 레이저는 50~100MHz의 고정 반복률로 작동하며, 이는 많은 이미징 연구에 적합합니다. 예를 들어 512 x 512 픽셀의 일반적인 이미지 크기와 몇 Hz의 프레임 속도를 고려해 보십시오. 노이즈를 줄이기 위해 각 픽셀에 다양한 여기 펄스가 있어야 하고 래스터 스캐닝을 위한 오버헤드가 요구되므로 10MHz 이상의 반복률이 필요합니다. 더 빠른 공명 스캔 실험에는 수십 MHz가 필요합니다. 

가장 일반적으로 사용되는 지표는 400nm~550nm 사이의 파장(자색광에서 녹색광까지)을 가진 단일 광자 영역에서 여기됩니다. 이것은 이광자 영역에서 대략 750nm와 1100nm 사이의 파장(근적외선)에 해당하며, 이는 티타늄 사파이어 활성 매질에 기반한 조정 가능한 레이저와 완벽하게 일치합니다.

표 1: 다광자 여기를 위한 최적의 레이저 매개변수에 대한 요약.

마지막으로, 여러 연구를 통해 대부분의 샘플이 이러한 근적외선 파장에서 100~200mW의 평균 레이저 출력을 견딜 수 있는 것으로 나타났습니다. 이 출력은 오늘날의 다양한 이미징 및 기능적 형광 프로브로 밝은 이미지를 제공할 수 있는 충분한 출력입니다. 일부 현미경의 처리량은 10% 정도로 낮기 때문에 1~2와트의 레이저 출력이 필요합니다.

표 1에 요약된 바와 같이, 이러한 요구 사항은 Coherent의 Chameleon 시리즈와 같은 조정 가능한 싱글박스 및 자동화된 티타늄 사파이어(Ti:S) 레이저에 의해 충족됩니다. 전체적으로 전 세계의 실험실에서 이광자 현미경 검사에 사용되는 이러한 유형의 Ti:S 레이저가 5,000개 이상 있는 것으로 추정됩니다.

삼광자 현미경 검사를 위한 레이저 소스 요구 사항

이광자 현미경에 비해 삼광자 현미경은 상대적으로 아직 초기 단계에 있습니다. 그러나 더 깊은 이미징(예: 신경과학)에 몇 가지 이점을 제공하기 때문에 그에 대한 사용이 매우 빠르게 증가하고 있습니다.

레이저 요구 사항은 이광자 여기에 비해 상당히 높은 피크 전력이 필요한 삼광자 이벤트의 훨씬 낮은 확률에 의해 결정됩니다. 약 100~200배 더 높음. 펄스 폭이 더 짧거나 펄스 에너지가 더 높은 레이저를 사용하면 피크 출력을 높일 수 있습니다. 그러나 왜곡되고 확장된 펄스를 피하는 분산 관리는 현미경 시스템을 통해 사용 가능한 가장 짧은 모드 잠금(예: 10fs) 펄스를 전송할 때 문제가 됩니다. 결과적으로 삼광자 여기에 40~60fs 펄스를 사용하면 높은 피크 전력과 합리적으로 단순한 펄스 관리 사이에 좋은 균형을 제공합니다. 

이 펄스 지속 시간은 이광자 레이저의 일반적인 펄스 지속 시간보다 약 3배 더 짧으며, 이는 이러한 레이저에 비해 펄스 에너지가 여전히 40~50배 증가해야 함을 의미합니다. 이광자 현미경 레이저는 10-40nJ 범위의 출력 펄스 에너지를 갖는 반면, 유사한 광학 손실을 가진 삼광자 현미경은 0.5~2mJ의 레이저 출력이 필요합니다.

이 펄스 에너지에 도달할 수 있는 한 가지 방법은 처프 펄스 증폭(CPA)이라는 기술을 사용하여 Ti:S 레이저의 출력을 증폭하는 것입니다. CPA는 1990년대에 Gerard Mourou와 Donna Strickland에 의해 발명되었으며 이는 매우 중요하고 보편적으로 사용되어 2018년 그들에게 노벨 물리학상을 안겨주었습니다.

이테르븀은 전력 확장의 핵심입니다

반복률과 평균 출력은 어떨까요? 여기서 주요 고려사항은 샘플 생존력입니다. 샘플 생존력을 유지하기 위해 샘플의 평균 출력을 200mW 미만으로 유지해야 한다는 것은 수많은 이광자 연구를 통해 확립되었습니다. 이전 섹션에서 삼광자 이미징에 필요한 펄스당 에너지가 이광자 여기의 경우보다 40~50배 더 높아야 한다고 설명했습니다. 이는 예를 들어 반복률이 1~2MHz로 낮아져야 함을 의미합니다. 더 빠른 이미징을 위해 반복률을 4~5MHz로 높일 수 있지만 샘플의 펄스당 에너지가 비례하여 감소하는 경우에만 가능합니다.

안타깝게도 Ti:S 결정의 물리적 특성으로 인해 이러한 레이저를 비실용적으로 만들 수 있습니다. 반면에 이테르븀 도핑 파이버를 기반으로 하는 레이저 시스템은 이러한 문제를 해결할 수 있습니다. 이는 Yb 도핑된 활성 파이버를 사용하면 더 긴 거리에 펄스의 증폭을 분산시켜(파이버를 감아 컴팩트한 구성으로 만들 수 있음) Ti:S 증폭기로 달성할 수 없는 높은 반복률에서도 충분한 이점을 제공하기 때문입니다.

그림 1은 이러한 유형의 Yb 파이버 증폭기의 일반적인 아키텍처를 개략적으로 보여줍니다. Ti:S 레이저 증폭기와 마찬가지로 첫 번째 단계(시드 레이저 + 전치 증폭기)는 수십 MHz에서 모드 잠금 펄스 스트림을 생성합니다. 음향 광학 변조기(AOM)는 이 펄스 트레인을 게이팅하고 반복률을 정수 N만큼 떨어뜨립니다. 그림을 참조하면 N = 50인 경우 전력 증폭 단계에서 1MHz 펄스 트레인이 CPA에 의해 증폭됩니다.

이 아키텍처는 매우 유연하고 전력 확장성이 뛰어나며 1MHz~50MHz의 반복률에서 지원되는 최대 60와트 이상의 평균 출력을 쉽게 생성할 수 있습니다. 펄스당 에너지는 광학 파이버 손상 시작에 의해 제한되며 일반적으로 펄스당 100mJ 미만으로 유지됩니다.

CPA 기반 Yb 레이저는 1030~1070nm의 고정 파장에서 작동하며 게인 대역폭은 약 250fs의 펄스를 지원할 수 있습니다. 파장이나 펄스 지속 시간은 모두 삼광자 현미경과 직접 호환되지 않으므로 다음 섹션에 설명된 대로 추가 펄스 처리가 필요합니다. 참고로, 이 Yb 레이저는 소위 적색 편이 옵신(red-shifted opsins)이라고 불리는 이광자 광유전학, 즉 공간 광변조기를 사용하는 많은 뉴런에 높은 출력 전력이 "확산"되는 Yb 레이저 파장에서 여기 가능한 이광자 광유전학에 매우 인기가 있습니다.

삼광자 여기를 위한 파장 요구 사항

삼광자 현미경의 경우 녹색 형광 단백질을 기반으로 하는 프로브를 여기시키는 데 필요한 파장은 약 1300nm이며 적색 편이 프로브의 경우 약 1700nm입니다. 이 두 가지 파장 영역 중에서 1300nm가 더 유익한 삼광자 이미징 "창"으로 입증되고 있으며, 이 점은 본 논문의 후반부에서 설명될 것입니다. 또한 효율적인 삼광자 여기는 40~60fs의 펄스 폭을 필요로 합니다. 그렇다면, Yb 레이저를 사용하여 이 성능을 얻을 수 있는 방법은 무엇입니까?

삼광자 현미경의 요구 사항을 충족하기 위해 파장과 펄스 폭을 모두 변환하는 가장 일반적인 방법은 조정 가능한 파장 광 매개변수 증폭기(OPA)를 사용하는 것입니다. 이 장치는 (Yb 레이저로부터의) 펌프 파장을 두 개의 더 긴 파장으로 변환합니다. 여기서 광자 에너지의 합은 펌프 광의 광자 에너지와 같습니다. 이러한 에너지 보존은 다음과 같이 표현할 수 있습니다.

                          1/λp=1/λs+1/λi

여기서 λ는 파장을 나타내며 p, s 및 I는 "펌프" 파장과 일반적으로 "신호" 및 "유휴" 파장이라고 불리는 OPA에 의해 생성된 두 개의 파장을 식별합니다. 역사적인 이유로 유휴 파장이 항상 두 파장 중 더 짧습니다.

그림 2는 OPA가 삼광자 현미경을 위해 필요한 파장을 생성하는 방법을 개략적으로 보여줍니다. Yb 레이저 출력의 작은 부분은 얇은 판에서 광대역 "백색광 연속체"를 생성하는 데 사용됩니다. 그런 다음 백색광은 사용자가 선택한 특정 파장에서 파라메트릭 증폭에 적합한 비선형 크리스털로 증폭됩니다. 나머지 Yb 레이저 출력은 주파수가 두 배가 되어 OPA의 "펌프" 파장인 515~520nm에서 녹색광을 생성합니다. 이러한 배열을 통해 OPA는 가령 1300nm의 유휴 파장을 생성할 수 있으며 이는 인기 있는 "녹색" 프로브의 삼광자 여기와 일치합니다. 에너지 보존을 위해서는 신호 파장이 860nm여야 합니다.

연속체의 백색광 특성을 고려할 때, OPA 사용자는 두 출력 파장을 어떻게 선택합니까? 이것은 위상 매칭, 즉 크리스털의 광축과 펌프 빔 사이의 각도 조정을 통해 이루어집니다. 크리스털을 기울이면 백색광에서 증폭할 파장의 쌍을 선택할 수 있습니다. 조정 가능한 OPA는 수동 또는 전동 및 컴퓨터 제어 단계를 가지고 있어 선호하는 신호 파장의 선택을 단순화합니다.

펄스 폭 요구 사항의 일치

삼광자 현미경 검사에서 중요한 것처럼, OPA의 특정 설계는 펌프 펄스보다 훨씬 짧은 펄스를 생성할 수 있게 합니다. 구체적으로, 펌프 빔과 신호 빔이 OPA 크리스털에서 서로 다른 각도로 전파되는 "비공선형" 설계를 사용하여 20~25fs의 짧은 펄스를 생성할 수 있습니다. 이 비공선형 접근 방식은 일반적으로 940~1250nm 사이의 조정 범위에서 약 300nm의 간격을 남깁니다. 다행히 이 영역은 삼광자 여기와 관련이 없습니다.

관련된 비선형 공정(Yb 레이저의 주파수 2배 증가 및 파라메트릭 생성)으로 인해 전체 시스템의 효율성은 상대적으로 낮습니다. Yb 레이저의 전력 스케일링은 바로 여기에서 성과를 나타냅니다. Coherent Monaco와 같은 강력한 Yb 레이저는 펄스당 수십 µJ을 전달합니다. 이것은 1300 또는 1700nm에서 OPA로부터 펄스당 몇 µJ을 생성하며, 이는 삼광자 여기를 위한 광학 "창"과 일치합니다. 그림 3은 많은 연구진들이 사용하는 설정인 1MHz 및 4MHz에서 60W로 펌핑되는 OPA(Coherent Opera-F)의 일반적인 튜닝 곡선을 보여줍니다.

동시 멀티 프로브 이미징

이전 섹션에서 우리는 녹색 형광자 단백질 및 유전적으로 암호화된 칼슘 지표의 GCaMP 제품군과 같은 삼광자 방식의 중요한 프로브를 여기시키는 핵심 파장으로 1300nm를 언급했습니다. 여기서 삼광자는 920nm에서 이광자와 동일한 에너지를 전달합니다. 유사하게, 이광자 여기를 사용하여 약 1050nm에서 여기되는 소위 "적색 편이" 프로브는 1600~1700nm에서 삼광자 방식으로 여기될 수 있습니다. 이러한 프로브에는 m-Fruit 형태 프로브와 RCaMP 칼슘 프로브가 포함됩니다. – 그림 4도 참조. 

대부분의 삼광자 작업은 1300nm에서 수행되었지만 1600~1700nm의 더 긴 파장에서 개념적으로 여기 가능한 적색 편이 프로브의 사용은 여전히 현미경 커뮤니티의 관심 대상입니다. 이것은 이상적인 삼광자 레이저가 2색 여기 이미징의 경우 두 파장을 동시에 생성할 수 있어야 함을 나타내는 것처럼 보입니다. 더 긴 파장은 낮은 조직 분산 때문에 훨씬 더 깊은 이미징이 가능하지만, 수분 흡수는 1300nm에서보다 1700nm에서 더 높기 때문에 샘플 열 손상 가능성이 더 높다는 것을 의미합니다.

그러나 몇몇 발표된 연구에 따르면 1300nm는 녹색 및 적색 형광 프로브 모두 또는 적어도 그중 다수를 여기시키는 데 사용될 수 있습니다. 그런 다음 두 프로브의 형광 방사는 파장 선택 필터를 사용하여 쉽게 분리됩니다. 예를 들어, 2021년에 Chris Xu는 다색 형광체의 단일 파장 3P 여기에 대한 획기적인 논문을 발표했습니다(Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation with single-wavelength excitation in deep | Science Advances). 

보다 최근에는 Timo van Kerkoerle과 그의 박사과정 학생인 Marie Guillemant가 1300nm로 조정된 Coherent Monaco와 Opera-F를 사용하여 3P 여기를 통해 쥐의 전두엽 피질에서 덱스트란 및 tdTomato 표식 중간 뉴런의 동시 여기를 입증했습니다(그림 5). 그림 4의 z-스택 이미지는 적색 편이 프로브에서 약 1mm 깊이까지 상당한 신호를 보여줍니다.

이 접근 방식에는 두 개의 OPA가 필요하지 않을 뿐만 아니라 파장 튜닝이 있는 OPA도 필요하지 않습니다. Coherent는 이 다중 프로브 접근 방식을 더욱 쉽게 구현하기 위해 Coherent Monaco 1300이라는 1300nm 펨토초 펄스의 원박스 고정 파장 소스를 도입했습니다. 이 소형 소스는 완전히 통합된 핸즈프리 레이저로, 최대 2.5W의 출력 전력을 제공하며 1MHz, 2MHz 또는 4MHz 반복률과 50fs 미만의 펄스 폭을 선택합니다. 이러한 모든 매개변수는 깊은 삼광자 이미징에 이상적으로 일치하므로 Coherent Monaco 1300은 특히 삼광자 현미경을 다루는 최초의 싱글박스 턴키 광원입니다. 

삼광자 이미징의 출현과 인기를 인식하여 Coherent Monaco 1300의 설계에는 Coherent Chameleon Discovery 및 Axon과 같은 이광자 현미경을 위한 가장 진보된 레이저의 일부인 사용자를 위한 이점이 통합되어 있습니다. 실제로 Coherent Monaco 1300은 즉걱적인 전력 감쇠/게이팅을 제공하는 전체 출력 제어(TPC) 옵션과 모든 유형의 현미경 설정을 통해 샘플에서 최적의 펄스 폭을 위한 분산 사전 보상을 제공하는 소형 펄스 압축기(CPC) 옵션을 싱글박스에 제공합니다.