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Ultrastabiler Femtosekunden-Verstärker ermöglicht eine hohe Datenleistung bei 2D-IR-spektroskopischen Untersuchungen biologischer Membranen und Tenside
Überblick
Forscher im Labor von Prof. Carlos Baiz (University of Texas, Austin) untersuchen die Dynamik von hydrophilen bzw. hydrophoben Grenzflächen, um die Funktion von biologischen Membranen und industriellen Tensiden im Detail besser zu verstehen. Sie machen ausgiebig Gebrauch von Gerätschaften für zweidimensionale Infrarotspektroskopie, die auf einem Astrella-Ultrakurzpuls-Laserverstärker basieren. Gemessen an den veröffentlichten Daten, hat die Kombination aus Leistungsstabilität und einfacher Bedienung einen hohen Labordurchsatz ermöglicht.
Praktische Membranen und industrielle Tenside
Professor Baiz erklärt die Motivation seiner Forschung: „Die traditionelle Forschung im Bereich der Tenside und Lipidmembranen zielt auf einfache Modellsysteme ab, an denen eine einzige Lipid- oder Tensidart beteiligt ist. Dies hat zwar wichtige Informationen geliefert, jedoch spiegelt dieses Verständnis nicht immer die realen Systeme wider. Biologische Membranen enthalten zum Beispiel Hunderte oder sogar Tausende verschiedener Lipide. Nun wissen wir, dass die Biologie von Natur aus zur Effizienz neigt. Diese unerwartete chemische Vielfalt dient also zweifellos einem wichtigen Zweck. In unserer Forschung untersuchen wir die Rolle der Membranheterogenität bei der Faltung bestimmter Proteine, die die Zellfunktionen steuern.“ Er fügt hinzu, dass eine ähnliche chemische Vielfalt auch in der Welt der industriellen Tenside zu finden ist, die für Anwendungen wie Ölgewinnung und Schmierung verwendet werden. Unabhängig davon, ob diese aus petrochemischen Quellen oder aus biologischen Quellen wie Palmöl stammen, sind die Moleküle durch viele Unterschiede in Bezug auf Kettenlängen, funktionelle Gruppen, Verzweigungen usw. gekennzeichnet.
„Die Prinzipien der 2D-Spektroskopie sind gut verstanden, aber die Umsetzung war bisher oft recht komplex.“
Die einzigartige Leistungsfähigkeit der 2D-IR-Spektroskopie
Die 2D-IR-Spektroskopie ist eines von mehreren leistungsstarken Werkzeugen, die die Gruppe um Baiz in ihrer Forschung einsetzt. Die Prinzipien der 2D-Spektroskopie sind gut verstanden, aber die Umsetzung war bisher oft recht komplex. Bei einer konventionellen (eindimensionalen) Infrarot-Absorptionsmessung wird die Absorptionsmenge in Abhängigkeit von einem einzigen Parameter, der Infrarotfrequenz, gemessen, wobei in der Regel ein FTIR-Spektrometer (Fourier-Transform-Spektrometer) verwendet wird. Jeder Absorptionsspitzenwert entspricht einer anderen Molekularschwingung. Bei der 2D-IR-Methode wird die Absorption effektiv durch zwei Infrarotquellen gemessen. Diese werden als Pumpe und Sonde bezeichnet. Die Daten werden dann in der Regel als 2D-Konturkarte in den beiden Frequenzen aufgezeichnet, wobei die Diagonale nur das lineare Spektrum darstellt. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wird die Signalintensität in diesen Datenplots mit Falschfarben dargestellt. [1]
Wieso? Was genau liefert dieser recht komplexe experimentelle Ansatz, das Sie auf anderem Wege nicht so leicht erhalten können? Das Vorhandensein von Peaks außerhalb der Diagonalen zeigt Ihnen, dass diese beiden Schwingungen gekoppelt sind – entweder teilen sie sich ein oder mehrere Atome oder sie sind durch eine Art von chemischer Wechselwirkung eng miteinander verbunden. Die Form der Peaks offenbart beispielsweise die homogenen und inhomogenen Verbreiterungskomponenten, was wiederum dynamische Informationen über die Interaktion der Moleküle mit ihrer nahen Umgebung liefert. Auch andere, subtilere Informationen können durch Analyse und Modellierung aus dem Datensatz extrahiert werden.
Während die Daten im Frequenzbereich aufgezeichnet werden, wird die 2D-Spektroskopie heute meist im Zeitbereich unter Verwendung von Ultrafast Laserpulsen durchgeführt, wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Die Probe wird mit zwei breitbandigen Femtosekunden-Pumppulsen angeregt, die alle Frequenzen von Interesse enthalten. Die Verzögerung zwischen den beiden Pumppulsen wird dann wiederholt abgetastet und die daraus resultierende Auswirkung auf den Sondenpuls wird per schneller Fourier-Transformation in den Frequenzbereich umgewandelt. (Konzeptionell ist das Verfahren der FT-NMR-Methode ähnlich). Der Sondenpuls ist ebenfalls ein breitbandiger Femtosekundenpuls, der alle Frequenzen von Interesse enthält. Nachdem dieser die Probe durchlaufen hat, wird sie auf einem Monochromator dispergiert, um direkt die Frequenzachse der Sonde zu erhalten. Da die Spektren mit Laserpulsen aufgenommen werden, kann auch die Verzögerung zwischen Pumpe und Sonde gesteuert werden, um das zeitliche Verhalten, z. B. die Kohärenzzeit, all dieser Effekte zu zeigen.
Abbildung 1: Bei der 2D-IR-Spektroskopie verursacht ein Paar breitbandiger Pumppulse im mittleren Infrarot eine Schwingungskohärenz in der Probe. Nach einer kurzen Verzögerung wird ein dritter breitbandiger Puls angelegt, um das gemessene Signal dritter Ordnung zu erzeugen. Abbildung mit freundlicher Genehmigung des Labors von Baiz.
Ein robustes experimentelles System mit vielfältigen Möglichkeiten
Baiz merkt an: „Das 2D-IR-Verfahren ist nachweislich eine hervorragende Methode, um die Dynamik von Wasserstoffbrückenbindungen in Lipidmembranen zu untersuchen. Es ist der Unterschied zwischen hydrophil und hydrophob, der die Grenzfläche definiert, und die Dynamik der Wasserstoffbrückenbindungen ist an der Grenzfläche im Vergleich zur Masse stark gestört.“ Baiz fügt hinzu, dass ein weiterer Vorteil des 2D-IR-Verfahrens für seine Studien das relativ starke Signal ist, das von Carbonyl-Streckschwingungen (C=O) erhalten werden kann. Die meisten gängigen Lipide haben diese Carbonylgruppen und diese spielen eine Schlüsselrolle bei der Wasserstoffbrückenbindung mit Wasser. Somit passt das also hervorragend zu seiner Arbeit, die auf Lipide in verschiedenen heterogenen Gruppen abzielt. [2-3]
Die Laserquelle im 2D-IR-Aufbau ist ein Coherent Astrella in Verbindung mit einem abstimmbaren optischen parametrischen Verstärker (Coherent TOPAS Prime mit NDFG). Astrella ist ein einzigartiger Ein-Box-Verstärker, der 100 fs-Pulse bei einer zentralen Wellenlänge um 800 nm erzeugt. Der OPA/NDFG-Aufbau erzeugt Pulse, die im gesamten mittleren Infrarotbereich abstimmbar sind. Im Aufbau von Baiz wird es in der Regel auf eine zentrale Wellenlänge zwischen 5,7 und 6,2 Mikrometern eingestellt, was einer Frequenz von 1.750–1.580 cm-1 entspricht, um den Carbonyl-Streckschwingungen in Lipiden und Proteinen zu entsprechen. Die Pulsbreite von 100 fs bietet eine ausreichende spektrale Abdeckung, um Lipid-Ester-Carbonyle und Protein-Amid-Carbonyle während der gleichen Messungen zu untersuchen.
„Das 2D-IR-Verfahren ist nachweislich eine hervorragende Methode, um die Dynamik von Wasserstoffbrückenbindungen in Lipidmembranen zu untersuchen.“
Thermometrie mit gleichzeitiger räumlicher und zeitlicher Auflösung
Abbildung 2 zeigt schematisch die wichtigsten Elemente des im Labor von Baiz verwendeten 2D-IR-Aufbaus. In den Anfängen der Ultrafast 2D-IR-Experimente wurden die einzelnen Pulse mit speziell angefertigten Geräten erzeugt. Sie wurden auf unterschiedlichen Strahlengängen erzeugt, was eine erhebliche Herausforderung bei der Ausrichtung darstellte, um alle Strahlen mit interferometrischer Qualität auf der Probe zu überlappen. Heute verwenden Forscher wie Baiz einen kommerziellen Pulsformer (den Quickshape von PhaseTech Spectroscopy Inc.), um die eng beieinander liegenden Anregungspulse zu erzeugen. Alle Pulse werden auf einem einzigen kollinearen Strahlengang erzeugt, was die Experimente erheblich vereinfacht.
Die fortschrittlichen elektronischen Pulsverzögerungsfähigkeiten des Coherent Astrella Signalverzögerungsgenerators (SDG Elite) sind für einige der fortschrittlicheren Experimente nützlich, wie z. B. die transiente 2D-IR-Spektroskopie. In diesem Modus wird ein zusätzlicher UV-Laser verwendet, um chemische Reaktionen auszulösen, die dann über das 2D-IR-Verfahren verfolgt werden. [4] Analog zu den traditionellen „Pump-Probe“-Methoden kann man sich diese Implementierung als „UV-Pump-2D-IR-Sonde“ vorstellen. Die mehreren Ausgänge des SDG Elite werden zur Synchronisierung der verschiedenen Komponenten des optischen Aufbaus verwendet, wie in Abbildung 2 gezeigt.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der wichtigsten Elemente des 2D-IR-Aufbaus. Das Coherent Astrella System umfasst den Vitara Oszillator, den Revolution Pumplaser und den Ti:Saphir-Hauptverstärker. Der Signal-Delay-Generator wird verwendet, um die elektronischen Steuerpulse zur Synchronisierung des Aufbaus zu erzeugen. Abbildung mit freundlicher Genehmigung des Labors von Baiz.
Laserstabilität ermöglicht lange Datenerfassungszeiten
Der Astrella wird bei Coherent unter Verwendung von HALT/HASS-Protokollen entwickelt und hergestellt. Diese haben zu einer unübertroffenen Laserstabilität und Zuverlässigkeit geführt. HALT steht für Highly Accelerated Life Testing und HASS steht für Highly Accelerated Stress Screening. Baiz führt die herausragende Stabilität von Astrella als einen entscheidenden Faktor für seine Studien an.
Das liegt daran, dass viele der 2D-IR-Experimente, die in der Gruppe um Baiz durchgeführt werden, oft Datenerfassungszeiten von 16–24 Stunden pro Probe erfordern und jeder Aspekt der Laserleistung während dieser gesamten Zeit völlig stabil bleiben muss. Der Grund für die langen Datenzeiten ist die geringe Signalstärke. Er erklärt: „2D-IR-Signale sind schwach, da die Oszillatorstärken von IR-Übergängen typischerweise viel niedriger sind als elektronische Übergänge. Darüber hinaus verwenden wir die Isotopensubstitution. Um eine Lipidarten in einem heterogenen Gemisch zu finden, markieren wir dieses Lipid mit Kohlenstoff-13, um seine Carbonyl-Strecke auf eine niedrigere Frequenz zu verschieben. Wenn unser Ziellipid also etwa 5 % der Gesamtmenge ausmacht, bedeutet dies einen weiteren Rückgang der Signalstärke. Wenn wir dann noch zeitabhängige Studien durchführen wollen, wird das Experiment noch länger.“
Einfacher Betrieb minimierte die Auswirkungen der Pandemie im Labor von Baiz
Im Labor von Baiz wird der 2D-IR-Aufbau von mehreren Studenten und Postdoktoranden gemeinsam genutzt. Daher ist die langfristige Zuverlässigkeit und einfache Bedienung von Astrella ebenso wichtig wie die Stabilität der Ausgabe. Baiz erklärt: „Die Studenten erhalten die exklusive Nutzung in Zeitblöcken von in der Regel zwei Wochen Dauer. Damit diese Planung reibungslos und fair funktioniert, brauchen wir eine verlässliche On-Demand-Leistung. Das bekommen wir mit Astrella. Wir haben festgestellt, dass die beste Lösung darin besteht, den Laser im Dauerbetrieb die gesamte Woche laufen zu lassen und ihn einfach zu vergessen. Ich möchte noch hinzufügen, dass wir auch einen großartigen Servicevertrag haben, der uns in den seltenen Fällen, in denen wir ein Problem mit dem Laser haben, fast sofort wieder auf die Beine bringt.“ Baiz sagt, dass die einfache Bedienung des Astrella – „Es ist wirklich nur eine Lichtquelle“ – es seinen Studenten immer ermöglicht hat, sich ganz auf ihre Experimente zu konzentrieren ohne sich dabei um den Laser kümmern zu müssen. Dies war besonders wichtig für die Laborproduktivität während der Pandemiebeschränkungen im Jahr 2020 aufgrund von Covid. Er merkt an: „Die Einschränkungen der Universität hatten zur Folge, dass immer nur eine Person in unserem Labor arbeiten konnte. Junge Studierende mit minimaler Erfahrung im Umgang mit einem Ultrafast Laserverstärker mussten also ohne direkte Hilfe oder Aufsicht arbeiten. Doch diese personelle Einschränkung hatte keinerlei Auswirkungen auf die Produktivität unseres Labors, denn allein im Jahr 2020 wurden 10 Arbeiten eingereicht.“
Einzigartige Informationen aus diesen 2D-IR-Studien
Ein Beispiel für die aufregende neue Wissenschaft, die die 2D-IR-Spektroskopie offenbart, ist in Abbildung 3 zu sehen, die die simulierten Details eines in eine Lipidmembran eingebetteten Proteins zeigt. Die traditionelle Ansicht war, dass Wasser generell aus dem hydrophoben Inneren ausgeschlossen ist. Daten aus isotopenmarkierten 2D-IR-Experimenten haben jedoch gezeigt, dass das Eindringen von Wasser in den Membrankern erheblich ist. Dieser Schnappschuss stammt aus einer Simulation der Molekulardynamik (MD) eines amphiphilen Peptids in einer Membran, die auf diesen Daten basiert. Beachten Sie, dass selbst in einer Tiefe von etwa 1 nm in der hydrophoben Region (Acylkette) Wassermoleküle Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Backbone eingehen können. Der Einfachheit halber sind die umgebenden Lipide hier als halbtransparente Stäbchen dargestellt und nur die Wassermoleküle, die das Peptid umgeben, sind abgebildet. Die durchschnittlichen Positionen der Lipid-Kopfgruppen sind als gestrichelte Linien dargestellt.
„Die Einschränkungen der Universität hatten zur Folge, dass immer nur eine Person in unserem Labor arbeiten konnte. Junge Studierende mit minimaler Erfahrung im Umgang mit einem Ultrafast Laserverstärker mussten also ohne direkte Hilfe oder Aufsicht arbeiten.“
Abbildung 3: Das Eindringen von Wasser in hydrophobe Membranumgebungen.
Abbildung mit freundlicher Genehmigung des Labors von Baiz.
Zusammenfassung
2D-IR-Spektroskopie ist eine leistungsstarke Technik für chemische Untersuchungen auf der Ebene einzelner Bindungen. Fortschritte in diesem Bereich erlauben eine zunehmend einfachere technische Anwendung und erhöhen die Zuverlässigkeit von Systemen, insbesondere bei gebrauchsfertigen Ultrafast Lasern. Dadurch kann diese Methode nun in Forschungslaboratorien als On-Demand-Analyseverfahren eingesetzt werden. Und das mit der gleichen Zugänglichkeit und Zuverlässigkeit wie bei etablierten Routineverfahren wie FTIR.
Referenzen
[1] Flanagan, Jennifer C., Mason L. Valentine und Carlos R. Baiz. „Ultrafast Dynamics at Lipid–Water Interfaces.“ Accounts of chemical research 53.9 (2020): 1860-1868.
[2] Flanagan, Jennifer C., Alfredo E. Cardenas und Carlos R. Baiz. „Ultrafast Spectroscopy of Lipid–Water Interfaces: Transmembrane Crowding Drives H-Bond Dynamics.“ The Journal of Physical Chemistry Letters 11.10 (2020): 4093-4098.
[3] Flanagan, Jennifer C. und Carlos R. Baiz. „Site-specific peptide probes detect buried water in a lipid membrane.“ Biophysical journal 116.9 (2019): 1692-1700.
[4] Flanagan, Jennifer C. und Carlos R. Baiz.