Ultrastabiler Femtosekunden-Verstärker ermöglicht eine hohe Datenleistung bei 2D-IR-spektroskopischen Untersuchungen biologischer Membranen und Tenside

Die einzigartige Leistungsfähigkeit der 2D-IR-Spektroskopie

Die 2D-IR-Spektroskopie ist eines von mehreren leistungsstarken Werkzeugen, die die Gruppe um Baiz in ihrer Forschung einsetzt. Die Prinzipien der 2D-Spektroskopie sind gut verstanden, aber die Umsetzung war bisher oft recht komplex. Bei einer konventionellen (eindimensionalen) Infrarot-Absorptionsmessung wird die Absorptionsmenge in Abhängigkeit von einem einzigen Parameter, der Infrarotfrequenz, gemessen, wobei in der Regel ein FTIR-Spektrometer (Fourier-Transform-Spektrometer) verwendet wird. Jeder Absorptionsspitzenwert entspricht einer anderen Molekularschwingung. Bei der 2D-IR-Methode wird die Absorption effektiv durch zwei Infrarotquellen gemessen. Diese werden als Pumpe und Sonde bezeichnet. Die Daten werden dann in der Regel als 2D-Konturkarte in den beiden Frequenzen aufgezeichnet, wobei die Diagonale nur das lineare Spektrum darstellt. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wird die Signalintensität in diesen Datenplots mit Falschfarben dargestellt. [1]

Wieso? Was genau liefert dieser recht komplexe experimentelle Ansatz, das Sie auf anderem Wege nicht so leicht erhalten können? Das Vorhandensein von Peaks außerhalb der Diagonalen zeigt Ihnen, dass diese beiden Schwingungen gekoppelt sind – entweder teilen sie sich ein oder mehrere Atome oder sie sind durch eine Art von chemischer Wechselwirkung eng miteinander verbunden. Die Form der Peaks offenbart beispielsweise die homogenen und inhomogenen Verbreiterungskomponenten, was wiederum dynamische Informationen über die Interaktion der Moleküle mit ihrer nahen Umgebung liefert. Auch andere, subtilere Informationen können durch Analyse und Modellierung aus dem Datensatz extrahiert werden. 

Während die Daten im Frequenzbereich aufgezeichnet werden, wird die 2D-Spektroskopie heute meist im Zeitbereich unter Verwendung von Ultrafast Laserpulsen durchgeführt, wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Die Probe wird mit zwei breitbandigen Femtosekunden-Pumppulsen angeregt, die alle Frequenzen von Interesse enthalten. Die Verzögerung zwischen den beiden Pumppulsen wird dann wiederholt abgetastet und die daraus resultierende Auswirkung auf den Sondenpuls wird per schneller Fourier-Transformation in den Frequenzbereich umgewandelt. (Konzeptionell ist das Verfahren der FT-NMR-Methode ähnlich). Der Sondenpuls ist ebenfalls ein breitbandiger Femtosekundenpuls, der alle Frequenzen von Interesse enthält. Nachdem dieser die Probe durchlaufen hat, wird sie auf einem Monochromator dispergiert, um direkt die Frequenzachse der Sonde zu erhalten. Da die Spektren mit Laserpulsen aufgenommen werden, kann auch die Verzögerung zwischen Pumpe und Sonde gesteuert werden, um das zeitliche Verhalten, z. B. die Kohärenzzeit, all dieser Effekte zu zeigen.

Ein robustes experimentelles System mit vielfältigen Möglichkeiten

Baiz merkt an: „Das 2D-IR-Verfahren ist nachweislich eine hervorragende Methode, um die Dynamik von Wasserstoffbrückenbindungen in Lipidmembranen zu untersuchen. Es ist der Unterschied zwischen hydrophil und hydrophob, der die Grenzfläche definiert, und die Dynamik der Wasserstoffbrückenbindungen ist an der Grenzfläche im Vergleich zur Masse stark gestört.“ Baiz fügt hinzu, dass ein weiterer Vorteil des 2D-IR-Verfahrens für seine Studien das relativ starke Signal ist, das von Carbonyl-Streckschwingungen (C=O) erhalten werden kann. Die meisten gängigen Lipide haben diese Carbonylgruppen und diese spielen eine Schlüsselrolle bei der Wasserstoffbrückenbindung mit Wasser. Somit passt das also hervorragend zu seiner Arbeit, die auf Lipide in verschiedenen heterogenen Gruppen abzielt. [2-3]

Die Laserquelle im 2D-IR-Aufbau ist ein Coherent Astrella in Verbindung mit einem abstimmbaren optischen parametrischen Verstärker (Coherent TOPAS Prime mit NDFG). Astrella ist ein einzigartiger Ein-Box-Verstärker, der 100 fs-Pulse bei einer zentralen Wellenlänge um 800 nm erzeugt. Der OPA/NDFG-Aufbau erzeugt Pulse, die im gesamten mittleren Infrarotbereich abstimmbar sind. Im Aufbau von Baiz wird es in der Regel auf eine zentrale Wellenlänge zwischen 5,7 und 6,2 Mikrometern eingestellt, was einer Frequenz von 1.750–1.580 cm-1 entspricht, um den Carbonyl-Streckschwingungen in Lipiden und Proteinen zu entsprechen. Die Pulsbreite von 100 fs bietet eine ausreichende spektrale Abdeckung, um Lipid-Ester-Carbonyle und Protein-Amid-Carbonyle während der gleichen Messungen zu untersuchen.

Thermometrie mit gleichzeitiger räumlicher und zeitlicher Auflösung

Abbildung 2 zeigt schematisch die wichtigsten Elemente des im Labor von Baiz verwendeten 2D-IR-Aufbaus. In den Anfängen der Ultrafast 2D-IR-Experimente wurden die einzelnen Pulse mit speziell angefertigten Geräten erzeugt. Sie wurden auf unterschiedlichen Strahlengängen erzeugt, was eine erhebliche Herausforderung bei der Ausrichtung darstellte, um alle Strahlen mit interferometrischer Qualität auf der Probe zu überlappen. Heute verwenden Forscher wie Baiz einen kommerziellen Pulsformer (den Quickshape von PhaseTech Spectroscopy Inc.), um die eng beieinander liegenden Anregungspulse zu erzeugen. Alle Pulse werden auf einem einzigen kollinearen Strahlengang erzeugt, was die Experimente erheblich vereinfacht.

Die fortschrittlichen elektronischen Pulsverzögerungsfähigkeiten des Coherent Astrella Signalverzögerungsgenerators (SDG Elite) sind für einige der fortschrittlicheren Experimente nützlich, wie z. B. die transiente 2D-IR-Spektroskopie. In diesem Modus wird ein zusätzlicher UV-Laser verwendet, um chemische Reaktionen auszulösen, die dann über das 2D-IR-Verfahren verfolgt werden. [4] Analog zu den traditionellen „Pump-Probe“-Methoden kann man sich diese Implementierung als „UV-Pump-2D-IR-Sonde“ vorstellen. Die mehreren Ausgänge des SDG Elite werden zur Synchronisierung der verschiedenen Komponenten des optischen Aufbaus verwendet, wie in Abbildung 2 gezeigt.

Einfacher Betrieb minimierte die Auswirkungen der Pandemie im Labor von Baiz

Im Labor von Baiz wird der 2D-IR-Aufbau von mehreren Studenten und Postdoktoranden gemeinsam genutzt. Daher ist die langfristige Zuverlässigkeit und einfache Bedienung von Astrella ebenso wichtig wie die Stabilität der Ausgabe. Baiz erklärt: „Die Studenten erhalten die exklusive Nutzung in Zeitblöcken von in der Regel zwei Wochen Dauer. Damit diese Planung reibungslos und fair funktioniert, brauchen wir eine verlässliche On-Demand-Leistung. Das bekommen wir mit Astrella. Wir haben festgestellt, dass die beste Lösung darin besteht, den Laser im Dauerbetrieb die gesamte Woche laufen zu lassen und ihn einfach zu vergessen. Ich möchte noch hinzufügen, dass wir auch einen großartigen Servicevertrag haben, der uns in den seltenen Fällen, in denen wir ein Problem mit dem Laser haben, fast sofort wieder auf die Beine bringt.“ Baiz sagt, dass die einfache Bedienung des Astrella – „Es ist wirklich nur eine Lichtquelle“ – es seinen Studenten immer ermöglicht hat, sich ganz auf ihre Experimente zu konzentrieren ohne sich dabei um den Laser kümmern zu müssen. Dies war besonders wichtig für die Laborproduktivität während der Pandemiebeschränkungen im Jahr 2020 aufgrund von Covid. Er merkt an: „Die Einschränkungen der Universität hatten zur Folge, dass immer nur eine Person in unserem Labor arbeiten konnte. Junge Studierende mit minimaler Erfahrung im Umgang mit einem Ultrafast Laserverstärker mussten also ohne direkte Hilfe oder Aufsicht arbeiten. Doch diese personelle Einschränkung hatte keinerlei Auswirkungen auf die Produktivität unseres Labors, denn allein im Jahr 2020 wurden 10 Arbeiten eingereicht.“