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매우 안정적인 펨토초 증폭기로 생체 막 및 계면활성제에 대한 2D IR 분광 연구에서 높은 데이터 출력 가능

개요

Carlos Baiz 교수 (텍사스 대학교, 오스틴) 연구실의 연구원들은 생체 막과 산업용 계면활성제의 상세한 기능을 이해하기 위해 친수성/소수성 계면의 역학을 조사하고 있습니다. 이들은 Astrella 초고속 레이저 증폭기를 기반으로 하는 2차원 적외선 분광학 설정을 광범위하게 사용합니다. 여기서 출력 안정성과 작동 단순성의 조합을 통해 발표 가능한 데이터로 측정된 높은 실험실 처리량이 지원됩니다.

Enables High Data Output in 2D IR Spectroscopic Studies of Biological Membranes and Surfactants

실제 막 및 산업용 계면활성제

Baiz 교수는 연구 동기를 다음과 같이 설명합니다. "계면활성제와 지질막 모두에 대한 기존 연구는 단일 유형의 지질 또는 계면활성제 종과 관련된 단순한 모델 시스템을 목표로 했습니다. 이는 중요한 정보를 제공했지만 이러한 이해가 항상 실제 시스템을 반영하는 것은 아닙니다. 예를 들어 생체 막에는 수백 또는 수천 개의 서로 다른 지질이 포함되어 있습니다. 이제는 생물학이 자연스럽게 이러한 경향을 보인다는 사실을 알게 되었습니다. 개요 Carlos Baiz 교수 (텍사스 대학교, 오스틴) 연구실의 연구원들은 생체 막과 산업용 계면활성제의 상세한 기능을 이해하기 위해 친수성/소수성 계면의 역학을 조사하고 있습니다. 이들은 Astrella 초고속 레이저 증폭기를 기반으로 하는 2차원 적외선 분광학 설정을 광범위하게 사용합니다. 여기서 출력 안정성과 작동 단순성의 조합을 통해 발표 가능한 데이터로 측정된 높은 실험실 처리량이 지원됩니다. 매우 안정적인 펨토초 증폭기로 생체 막 및 계면활성제에 대한 2D IR 분광 연구에서 높은 데이터 출력이 가능하므로 효율이 증가하며, 이 예상치 못한 화학적 다양성은 의심할 여지 없이 중요한 목적을 수행합니다. 저희 연구에서는 세포 기능을 제어하는 특정 단백질의 접힘에 대한 막 이질성의 역할을 조사합니다." 그는 유사한 화학적 다양성이 오일 회수 및 윤활과 같은 응용 분야에 사용되는 산업용 계면활성제 영역에서도 발견된다고 덧붙입니다. 계면활성제가 석유화학 원료에서 유래하든 야자유와 같은 생물학적 원료에서 유래하든, 분자는 사슬 길이, 작용기, 분지 등의 측면에서 많은 차이점이 있는 것이 특징입니다.

"2D 분광학의 원리는 잘 알려져 있지만 구현은 매우 복잡한 경우가 많습니다."

2D IR 분광학의 고유한 능력

2D IR 분광학은 Baiz 교수 연구진이 연구에 사용하는 몇 가지 강력한 도구 중 하나입니다. 2D 분광학의 원리는 잘 알려져 있지만 구현은 매우 복잡한 경우가 많습니다. 기존(1차원) 적외선 흡수 측정에서 흡수량은 일반적으로 FTIR(푸리에 변환) 분광계를 사용하여 단일 매개변수인 적외선 주파수의 함수로 측정됩니다. 각 흡수 피크는 서로 다른 분자 진동에 해당합니다. 2D IR에서 흡수는 펌프와 프로브라고 하는 두 가지 적외선 소스의 결과로 효과적으로 측정됩니다. 그런 다음 데이터는 일반적으로 두 주파수에서 2D 등고선 지도로 표시되며, 여기서 대각선 플롯은 선형 스펙트럼일 뿐입니다. 그림 1과 같이 이러한 데이터 플롯에서 신호 강도를 나타내는 데 가색이 사용됩니다. [1]

이유가 무엇일까요? 다소 복잡한 실험적 접근 방식으로 제공되며 다른 방법으로는 쉽게 얻을 수 없는 것은 무엇일까요? 비대각선 피크의 존재는 이 두 진동이 결합되어 하나 이상의 원자를 공유하거나 일부 유형의 화학적 상호 작용으로 밀접하게 연결되어 있음을 나타냅니다. 예를 들어 피크의 모양은 균일 및 불균일 확장 구성 요소를 나타내며, 이는 차례로 분자와 주변 환경의 상호 작용에 대한 동적 정보를 제공합니다. 다른 미묘한 정보도 분석 및 모델링을 통해 데이터 세트에서 추출할 수 있습니다. 

데이터는 주파수 영역에 표시되지만 오늘날 대부분의 2D 분광학은 그림 1에 개략적으로 표시된 바와 같이 초고속 레이저 펄스를 사용하여 시간 영역에서 수행됩니다. 샘플은 모든 관심 주파수를 포함하는 두 개의 광대역 펨토초 펌프 펄스에 의해 여기됩니다. 그런 다음 두 펌프 펄스 사이의 지연이 반복적으로 스캔되고 프로브 펄스에 미치는 결과적인 영향은 주파수 영역으로 푸리에 변환됩니다. (FT-NMR이 수행되는 방식과 개념적으로 유사합니다). 프로브 펄스는 모든 관심 주파수를 포함하는 광대역 펨토초 펄스이기도 합니다. 이는 샘플을 통과한 후 모노크로메이터에 분산되어 프로브 주파수 축을 직접 얻습니다. 스펙트럼은 레이저 펄스를 사용하여 기록되므로 펌프와 프로브 사이의 지연을 제어하여 이러한 모든 효과의 시간적 동작(예: 가간섭성 시간)을 표시할 수도 있습니다.

Figure 1

그림 1: 2D IR 분광학에서 한 쌍의 광대역 중적외선 펌프 펄스는 샘플에서 진동 결맞음을 유발합니다. 짧은 지연 후 세 번째 광대역 펄스가 적용되어 측정된 3차 신호를 생성합니다. 그림 제공: Baiz 연구실.

다양한 기능을 갖춘 강력한 실험 시스템

Baiz는 다음과 같이 말합니다. "2D IR은 지질막 내 수소 결합의 역학을 조사하는 훌륭한 방법임이 제대로 입증되었습니다. 친수성/소수성의 차이는 계면을 정의하는 것이며, 수소 결합 역학은 벌크에 비해 계면에서 크게 파괴됩니다." Baiz는 그의 연구에서 나타나는 2D IR의 또 다른 이점은 카르보닐(C=O) 스트레칭 진동으로부터 얻을 수 있는 상대적으로 강한 신호라고 덧붙입니다. 대부분의 일반적인 지질에는 물과 수소 결합에 주요 참여자인 이러한 카르보닐기가 있기 때문에 다양한 이질적인 조합체에서 지질을 대상으로 하는 그의 연구에 매우 적합합니다. [2-3]

2D IR 설정의 레이저 소스는 조정 가능한 광 매개변수 증폭기(NDFG를 사용하는 Coherent TOPAS Prime)와 함께 사용되는 Coherent Astrella입니다. Astrella는 약 800nm의 중심 파장에서 100fs 펄스를 생성하는 고유한 원박스 증폭기입니다. OPA/NDFG 설정은 전체 중적외선에 걸쳐 조정 가능한 펄스를 생성합니다. 일반적으로 지질과 단백질의 카르보닐 스트레칭 진동과 일치시키기 위해 Baiz 설정에서 1,750~1,580cm-1의 주파수에 해당하는 5.7~6.2미크론 사이의 중심 파장으로 조정됩니다. 100fs 펄스 폭은 동일한 측정에서 지질 에스테르 카르보닐 및 단백질 아미드 카르보닐을 조사하기에 충분한 스펙트럼 범위를 제공합니다.

"2D IR은 지질막 내 수소 결합의 역학을 조사하는 훌륭한 방법임이 제대로 입증되었습니다."

 

동시 공간 및 시간 분해능을 통한 온도 측정

그림 2는 Baiz 연구실에서 사용되는 2D IR 설정의 주요 요소를 개략적으로 보여 줍니다. 초고속 2D IR 실험 초기에는 맞춤형 장비를 사용하여 별도의 펄스를 생성했습니다. 이 펄스는 다른 빔 경로에서 생성되어 간섭 측정 품질로 샘플의 모든 빔을 겹치게 하는 중대한 정렬 문제가 발생합니다. 오늘날 Baiz와 같은 연구원들은 상용 펄스 성형기(PhaseTech Spectroscopy Inc.의 Quickshape)를 사용하여 밀접하게 간격을 둔 여기 펄스를 생성하고 모든 펄스가 단일 공선 빔 경로에서 생성되어 실험이 매우 단순화됩니다.

Coherent Astrella 신호 지연 발생기(SDG Elite)의 고급 전자 펄스 지연 기능은 과도 2D IR 분광학과 같은 일부 고급 실험에 유용합니다. 이 모드에서는 추가 UV 레이저를 사용하여 화학 반응을 광트리거한 다음 2D IR을 통해 추적합니다. [4] 이 구현은 기존의 "펌프-프로브" 방법과 유사하게 "UV-펌프-2D IR 프로브"로 생각할 수 있습니다. SDG Elite의 다중 출력은 그림 2와 같이 광학 설정의 다양한 구성 요소를 동기화하는 데 사용됩니다.

 

Figure 2

그림 2: 2D IR 설정의 주요 요소를 보여 주는 개략도. Coherent Astrella 시스템에는 Vitara 발진기, Revolution 펌프 레이저 및 기본 티타늄 사파이어 증폭기가 포함됩니다. 신호 지연 발생기는 설정을 동기화하기 위해 전자 타이밍 펄스를 생성하는 데 사용됩니다. 그림 제공: Baiz 연구실.

 

레이저 안정성으로 긴 데이터 수집 시간 지원

Astrella는 HALT/HASS 프로토콜을 사용하여 Coherent에서 설계 및 제조되어 타의 추종을 불허하는 레이저 안정성과 신뢰성을 제공합니다. HALT는 초가속 수명 시험을 의미하고 HASS는 초가속 스트레스 검사를 의미합니다. Baiz는 그의 연구에서 중요한 가능 요인으로 Astrella의 뛰어난 안정성을 언급합니다.

Baiz 그룹에서 수행된 많은 2D IR 실험은 샘플당 16~24시간의 데이터 수집 시간이 필요한 경우가 많고 레이저 출력의 모든 측면은 이 전체 시간 동안 완전히 안정적으로 유지되어야 하기 때문입니다. 데이터 수집 시간이 긴 이유는 신호 강도가 작기 때문입니다. 그는 다음과 같이 설명합니다. "2D IR 신호는 IR 전환의 발진기 강도가 일반적으로 전자 전환보다 훨씬 낮기 때문에 약합니다. 또한 동위원소 치환을 사용합니다. 이질적인 혼합물에서 하나의 지질 종을 목표로 삼기 위해 해당 지질에 탄소-13으로 라벨을 지정하여 C=O 스트레치를 더 낮은 주파수로 이동시킵니다. 따라서 목표 지질이 전체의 5%를 나타내는 경우 신호 강도가 추가로 떨어지는 것입니다. 그래서 시간 의존적 연구를 하고자 한다면 실험이 훨씬 더 길어집니다."

 

Baiz 연구실에서 운영 단순성으로 팬데믹 영향 최소화

2D IR 설정은 Baiz 연구실의 여러 학생 및 박사 후 연구원이 공유 리소스로 사용하므로 Astrella의 장기적인 안정성과 간단한 작동은 출력 안정성만큼 중요합니다. Baiz는 다음과 같이 설명합니다. "학생들은 일반적으로 2주의 기간 동안 독점 사용 시간이 할당됩니다. 이 일정이 원활하고 공정하게 작동하려면 신뢰할 수 있는 주문형 성능이 필요합니다. 이를 Astrella에서 얻습니다. 사실 가장 좋은 해결책은 레이저를 24시간 연중무휴로 계속 작동시키고 본질적으로 잊어버리는 것입니다. 또한 레이저 문제가 있는 드문 경우에 거의 즉시 백업을 받을 수 있는 훌륭한 서비스 계약이 있음을 덧붙이고 싶습니다." Baiz는 Astrella의 작동 용이성("정말 단순한 광원") 덕분에 항상 학생들이 모든 에너지를 레이저가 아닌 실험에 집중할 수 있었다고 말합니다. 그러나 이는 코로나로 인한 2020년 팬데믹 제한 기간 동안 실험실 생산성에 특히 중요했습니다. 그는 다음과 같이 말합니다. "대학교의 제한 조치로 한 번에 한 사람만 우리 연구실에서 일할 수 있었습니다. 따라서 초고속 레이저 증폭기를 사용한 경험이 거의 없는 3학년 학생들은 직접적인 도움이나 감독 없이 작업해야 했습니다. 그러나 이러한 인력 제한으로 인해 2020년에만 10개의 논문이 제출되어 실험실 생산성이 전혀 저하되지 않았습니다."

 

이러한 2D IR 연구에서 얻은 고유 정보

2D IR 분광학에 의해 밝혀진 흥미진진한 새로운 과학의 일부 예는 지질막에 포함된 단백질의 시뮬레이션된 세부 사항을 보여 주는 그림 3에 나와 있습니다. 전통적인 견해는 일반적으로 소수성 내부에서 물이 배제된다는 것이었다. 그러나 동위원소로 표시된 2D IR 실험의 데이터는 막 중심 내의 상당한 수분 침투를 보여 주었습니다. 이 스냅샷은 이 데이터를 기반으로 하는 막의 양친매성 펩타이드의 분자 역학(MD) 시뮬레이션에서 얻은 것입니다. 소수성(아실 사슬) 영역의 ~1nm의 깊이에서도 물 분자는 뼈대와 H-결합이 가능합니다. 시각적 단순성을 위해 주변 지질은 반투명 막대기로 여기에 표시되고 펩타이드를 둘러싼 물 분자만 표시됩니다. 평균 지질 헤드그룹 위치는 점선으로 표시됩니다.

"대학교의 제한 조치로 한 번에 한 사람만 우리 연구실에서 일할 수 있었습니다. 따라서 초고속 레이저 증폭기를 사용한 경험이 거의 없는 3학년 학생들은 직접적인 도움이나 감독 없이 작업해야 했습니다."

그림 3: 소수성 막 환경으로의 물 침투.
그림 제공: Baiz 연구실.

요약

2D IR 분광학은 단일 결합 수준에서 화학성분을 조사하기 위한 강력한 기술입니다. 기술 단순성과 시스템 신뢰성, 특히 턴키 방식의 초고속 레이저의 발전 덕분에 이제 연구소에서 이 기술을 FTIR과 같이 잘 정립된 일상적인 방법과 동일한 접근성과 신뢰성을 갖춘 주문형 분석 방법으로 사용할 수 있습니다.

참고 문헌

[1] Flanagan, Jennifer C., Mason L. Valentine, and Carlos R. Baiz. “Ultrafast Dynamics at Lipid–Water Interfaces.” Accounts of chemical research 53.9 (2020): 1860-1868.
[2] Flanagan, Jennifer C., Alfredo E. Cardenas, and Carlos R. Baiz. “Ultrafast Spectroscopy of Lipid–Water Interfaces: Transmembrane Crowding Drives H-Bond Dynamics.” The journal of physical chemistry letters 11.10 (2020): 4093-4098.
[3] Flanagan, Jennifer C., and Carlos R. Baiz. “Site-specific peptide probes detect buried water in a lipid membrane.” Biophysical journal 116.9 (2019): 1692-1700.
[4] Flanagan, Jennifer C., and Carlos R. Baiz.

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