Dartmouth College

Die Herausforderung

Die Behandlung von Epilepsie und anderen genetisch bedingten neurologischen Erkrankungen könnte von der Grundlagenforschung im Labor von Professor Michael Hoppa am Dartmouth College profitieren. Es ist bekannt, dass diese Störungen mit einer fehlerhaften Signalübertragung – einer synaptischen Dysfunktion – in den komplexen Netzwerken von Neuronen, aus denen das Gehirn besteht, verbunden sind. Er erklärt: „Wir untersuchen, wie sich genetische Störungen auf das Aktionspotenzial (AP) und die damit verbundene Freisetzung von Chemikalien auswirken, die die grundlegenden Signalmechanismen für alle Neuronen darstellen. Wir führen detaillierte Untersuchungen mit einer räumlichen Auflösung im Submikrometerbereich und einer zeitlichen Auflösung von weit weniger als einer Millisekunde durch.“ Die räumliche Auflösung ermöglicht die Verfolgung von AP-Ereignissen in kleinen (<200 nm Durchmesser) Axonen sowie in anderen subzellulären Komponenten. Sie hoffen, dass ihre Erkenntnisse zu besseren Behandlungen und Ergebnissen führen können. 

Michael erklärt, dass seine Gruppe die Molekularbiologie nutzt, um die Gene für diese Störungen zu manipulieren, sowie die Physiologie und Pharmakologie in Kombination mit Optogenetik und quantitativer Fluoreszenzmikroskopie. Ein wichtiges Hilfsmittel ist die Verwendung von fluoreszierenden Spannungsindikatoren des Rhodopsin-Typs, die direkt auf das grundlegende Signal – den AP – abzielen, anstatt einem langsameren sekundären Signal wie der Kalziumfluoreszenz zu folgen. Die Qualität ihrer Daten hängt in hohem Maße von der Leistung der Laser ab, die für die Anregung und Abbildung der Indikatoren und anderer Sonden, die sie bei ihrer Arbeit verwenden, eingesetzt werden. Sie benötigen mehrere Laserwellenlängen, um verschiedene Sonden für ihre Studien selektiv anzuregen. Michael fügt hinzu: „Wir sind immer auf der Jagd nach dem Signal-Rausch-Verhältnis, d. h. nach Photonen, was bedeutet, dass wir zwischen 50 und 150 Milliwatt benötigen, je nach der besonderen Helligkeit der Sonde.“

Die Lösung

Zu Beginn dieser Arbeit benötigte Michael einen 637-nm-Laser mit einer Leistung von 150 mW. Er untersuchte mehrere Laser, bevor er sich für einen Coherent OBIS entschied und nannte mehrere Gründe für diese Wahl: „Eine Schlüsselanforderung für einen Großteil unserer Arbeit ist ein Laser mit analoger Hochgeschwindigkeitsmodulation und sehr stabilen Ausgangseigenschaften. Der OBIS-Laser war der einzige, den wir ausprobiert haben, der nicht nachweisbare Verzögerungszeiten und eine völlig stabile Leistung während des Pulsbetriebs lieferte.“ Er erklärt, dass dies notwendig war, weil die Spannungsanzeigen eine schnelle Reaktion von nur wenigen hundert Mikrosekunden haben. Sein Team benötigt also eine schnelle Modulation mit schnellen Anstiegs- und Abfallzeiten, um diese zeitliche Auflösung auszunutzen und die zeitlichen Details zu sehen, wie die AP geformt wird, die sich als sehr wichtig erweisen. Und die kurzen (z. B. 400 µs) quadratischen Pulse minimieren auch die Gesamtmenge des Lichts, dem die ausgeschnittenen lebenden Neuronen ausgesetzt sind. (Er sagt, dass eine frühe Überraschung ihrer Arbeit darin bestand, wie schnell die Gehirnneuronen von Säugetieren absterben, wenn sie einer kontinuierlichen Lichteinwirkung ausgesetzt sind. Natürlich leben sie normalerweise in völliger Dunkelheit im Inneren des Schädels.)

Die Stimulation der Neuronen wird oft mit einer kleinen Platinelektrode eingeleitet. Und seit 2017 hat die Gruppe auch optische Methoden mit der Patch-Clamp-Technologie kombiniert, um ihren Daten eine weitere Dimension hinzuzufügen. Insgesamt verfügt die Gruppe nun über 12 OBIS-Laser, die einen Großteil des sichtbaren Spektrums abdecken. Wie die Ausgänge mehrerer OBIS-Laser vor dem Mikroskop kombiniert werden, sehen Sie in einem coolen Video, das die Gruppe unter dem Titel Game of Photons erstellt hat. Die Bedienung erfolgt einfach über einen Touchscreen und eine einzelne Platine – ausgelöst durch Pulse von einem Arduino-Chip, der das gesamte experimentelle Timing mit bis zu 2000 Bildern/s steuert. Michael verweist auch auf die ausgezeichnete Zuverlässigkeit dieser Laser, von denen einige inzwischen über 7 Jahre alt sind und keinerlei Leistungsprobleme aufweisen. 

Das Ergebnis

Die Hoppa-Gruppe hat zahlreiche Arbeiten veröffentlicht, die auf diesen Techniken beruhen. Dabei ging es sowohl um Fortschritte bei den Methoden und Sonden selbst als auch um die Entschlüsselung neuer Details zur Rolle verschiedener spannungsgesteuerter Ionenkanäle. Michael sagt: „Ich glaube, wir haben gute Fortschritte bei der Identifizierung der Organisation, der Funktion und des therapeutischen Potenzials von Ionenkanälen und ihren Bindungspartnern in den Axonen und Synapsen gemacht, die den Informationsfluss im Gehirn steuern.“ Seine Forschungsgruppe wächst weiter; sie stellt derzeit sowohl Doktoranden als auch Post-Docs ein. Die treibende Kraft ist eindeutig Michaels ansteckender Enthusiasmus für die Wissenschaft: „Meine Vorstellung von einem Spielplatz besteht aus VIEL Lasern, Platinelektroden, Tonnen von Neuronen und Glia und einer Fülle von fluoreszierenden Proteinen.“ Wir freuen uns, dass er sich für ein Gebiet mit einer wichtigen potenziellen therapeutischen Wirkung entschieden hat, und wir freuen uns, dass er unsere Laser als Teil seines lustigen Spielplatzes ausgewählt hat. 

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