Spitzenleistung in der nicht-linearen Mikroskopie: Die Rhetorik auflösen

P_av ist die durchschnittliche Leistung des Lasers, F stellt die Pulswiederholungsrate dar und T_p repräsentiert die FWHM-Pulsdauer.

Bei einem Laser-Scanning-Mikroskop, bei dem die angeregten Sonden eine relativ kurze Fluoreszenzlebensdauer haben, hängt die zeitlich gemittelte Emission auch von der Geschwindigkeit ab, mit der diese Pulse an die Probe abgegeben werden können. Zu diesem Zweck kann die gesamte Fluoreszenzausbeute als Produkt aus der zeitlich gemittelten Leistung und der Spitzenleistung des Lasers wie folgt geschrieben werden:

Von hier aus ist es relativ einfach zu erkennen, welche Laserparameter angepasst werden können, um die Fluoreszenz einer Probe zu erhöhen. Der Haken daran ist, dass nicht alle dieser Parameter frei angepasst werden können, ohne Kompromisse bei der Lebensfähigkeit der Probe, der technischen Verwendbarkeit und/oder den Kosten einzugehen. Diese Kompromisse werden nun separat untersucht.

Lichtschäden in der Multiphotonenmikroskopie

Trotz zahlreicher Referenzen und Veröffentlichungen zu Phototoxizität und linearem Photoschaden in der konfokalen Bildgebung gibt es noch relativ wenige gezielte, systematische und quantitative Studien, die diese Dynamik für In-vivo- und In-vitro-MPE-Methoden und Probentypen untersuchen. 

Einige exzellente Einblicke und Hintergründe finden Sie bei Hell et al. [2] und Koenig [3]. Der Großteil der Diskussion in diesem Abschnitt basiert auf Schlüsselarbeiten der Gruppen um Hell [2], Piston [4] und Neher [5] sowie einer theoretischen Analyse der Photobleichungsmechanismen von Cheng et al. [6,7] Eine bekannte Ursache für Laserschäden ist die photothermische Wechselwirkung. Dies geschieht durch lineare Absorption der Grundwellenlänge der Ultrafast Laserquelle oder einer anderen CW- oder gepulsten Laserquelle. Die lineare Absorption hängt stark vom Probentyp und den verwendeten Wellenlängen ab, hängt jedoch ausschließlich von der durchschnittlichen von der Probe absorbierten Leistung ab und hat keinen Einfluss auf die momentane Spitzenleistung. Wasser beispielsweise, das in den meisten biologischen Proben vorherrscht, weist spezifische Absorptionslinien im nahen IR auf, und im Allgemeinen wird seine Absorption bei Verwendung von Wellenlängen über 1350 nm stärker. Zu den Auswirkungen auf eine Probe gehören lokale Erwärmung und letztendlich das Sieden des Wassers in der Probe, was zu Kavitation führt. Es ist jedoch zu beachten, dass Schäden bereits lange vor dem Auftreten von Kavitation eintreten können, dh wenn der lokale Temperaturanstieg die Grenze der Zelllebensfähigkeit überschreitet. Hell et al. [8] haben eine einfache, aber überzeugende Bewertung des Temperaturanstiegs in Proben durchgeführt, der nur durch lineare Wasserabsorption bestimmt wurde. Sie zeigten, dass die typische durchschnittliche Leistung, die bei MPE verwendet wird (~ 100 mW auf der Brennebene), einen Temperaturanstieg von < 1 °C verursacht, und kamen zu dem Schluss, dass bei diesen Proben thermische Schäden aufgrund der für MPE erforderlichen Laserleistung kein Problem darstellen. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass die Probentemperatur bei starker Absorption durch andere Spezies wie Hämoglobin oder Melanin viel dramatischer ansteigen kann. Beispielsweise wird in der menschlichen Haut die Durchdringung von 2P-Licht häufig durch die Melaninabsorption eingeschränkt [9]. Wenn nur lineare Effekte vorhanden sind, könnte man diese Effekte minimieren, indem man die Pulsdauer verringert und die Spitzenleistung erhöht, was sich positiv auf die nichtlineare Anregung auswirkt.

Photobleichung ist ein Mechanismus, der aufgrund des Abbaus der fluoreszierenden Spezies selbst zu einer schnellen Abnahme der Fluoreszenzemission einer Probe führt. Oftmals wird das Wort „Lichtschädigung“ verwendet, um darauf hinzuweisen, dass Lichtbleiche die Hauptursache für lichtinduzierte Schäden ist, obwohl es längerfristig auch andere Mechanismen geben kann. Diese Mechanismen können durch die Veränderung der Chemie im Zusammenhang mit der Photobleichung ausgelöst werden, können jedoch über längere Zeiträume als die Zeitskala der Photobleichung selbst (einige Sekunden oder mehrere zehn Sekunden) ablaufen. Die Mechanismen der Photobleichung sind komplex und werden in ihren verschiedenen Aspekten aktiv untersucht. Während Photobleichung sowohl bei 1- als auch bei 2-Photonen-Anregung stattfindet, ist sie bei 2-Photonen-Anregung auf die Fokusebene beschränkt. Es wurde erkannt, dass die Photobleichung bei Vorhandensein von Femtosekundenpulsen mit einer Leistung von mehr als 2 zunehmen kann, was auf eine Mischung aus 2-Photonen- und 3-Photonen-Prozessen oder sogar Prozessen höherer Ordnung hinweist [4, 5]. Eine einfache Erklärung für die höhere Nichtlinearität der Photobleichung ist in Abbildung 1 dargestellt. Hier wird ein Farbstoffmolekül (oder ein fluoreszierendes Protein) durch 2-Photonen-Absorption in den ersten Singulettzustand S1 angeregt; Durch Wechselwirkung mit weiteren Photonen wird das Molekül über den Prozess kb in noch höhere Zustände angeregt, was möglicherweise zu einer Dissoziation des Moleküls führt. Alternativ kann die Singulett-Zustandsanregung über Intersystem Crossing in einen Triplett-Zustand T1 überführt werden und dieser Zustand kann seine Energie über k in einen Singulett-Sauerstoffzustand übertragen _Ö.

Unabhängig von der Wahrscheinlichkeit des Intersystem Crossing ist klar, dass der größere Photonenfluss in MPE, insbesondere bei hohen Spitzenleistungen, die Wahrscheinlichkeit einer 3- oder 4-Photonen-Wechselwirkung erhöht, was zu einem stark nichtlinearen Term führt. 

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Erhöhung der Laserleistung an einer biologischen Probe schließlich zu einer Lichtschädigung führt, die linear (Absorption durch Wasser und andere Bestandteile) und nichtlinear (2P-Absorption, die zu einer zusätzlichen Absorption von einem oder mehreren Photonen führt, was zu einer Photobleichung führt) sein kann. Der thermische Schaden in der MPE-Mikroskopie kann durch Verringern der Pulsdauer (und damit der Durchschnittsleistung) verringert werden, die daraus resultierende Erhöhung der Spitzenleistung kann jedoch zu einem stärkeren nichtlinearen Photobleichen oder anderen Formen von Schäden führen. Es muss dann ein Kompromiss zwischen der Verringerung des thermischen Schadens und dem Einsetzen nichtlinearer Effekte bestehen.

Der Schaden hängt auch von der Wellenlänge ab. Eine Reihe von Arbeiten hat gezeigt, dass sich eine Erhöhung der Anregungswellenlänge von 700-800 nm auf 900-1,100 nm und sogar 1.250 nm positiv auf die Lebensfähigkeit der Probe auswirkt. Natürlich können nicht alle Sonden mit langen Wellenlängen angeregt werden, aber es scheint vorteilhaft, Fluorophore wann immer möglich auf der roten Seite ihres Anregungsspektrums anzuregen. Dies ist auch deshalb nützlich, weil längere Wellenlängen einer geringeren Streuung unterliegen und daher auch für eine tiefere Abbildung geeignet sind. Noch besser ist, dass längere Wellenlängen immun gegen Streuung sind, wie in den nächsten Abschnitten erläutert wird. All diese Elemente haben das MPE dazu veranlasst, Sonden einzusetzen, die im sicheren 920-1.100-nm-Bereich angeregt werden können. 

Während die Einschätzung zu längeren Wellenlängen einhellig zu sein scheint, bleibt die Auswahl einer idealen Pulsdauer eher subjektiv oder sogar ideologisch. Bevor wir weiter darauf eingehen, ist es sinnvoll, einen Blick auf die Handhabung kurzer Pulse in einem Mikroskopsystem zu werfen.

Verwalten der Ausbreitung von Femtosekundenpulse

Ultrafast Laserpulse mit einer bestimmten zeitlichen FWHM-Breite haben eine intrinsische minimale Frequenzbandbreite, die durch ihre zeitliche Pulsform bestimmt wird. Für einen für kommerzielle Ti:S-Laser typischen hypersekantenförmigen Puls (sech2) ist dies wie folgt gegeben:

Sech₂ Pulse, die ein Zeit-Bandbreiten-Produkt von 0,315 haben, werden als transformationsbegrenzt bezeichnet. Beispielsweise hat ein transformationsbegrenzter 800-nm-Puls mit 100 fs eine Bandbreite von 6,725 nm. In der Praxis ist es sehr schwierig, einen perfekten Puls zu erreichen, und bei Ti:S-Lasern liegt die Bandbreite normalerweise zwischen 1.1-1.3-Zeiten höher als die Transformationsgrenze.

Je kürzer die Breite eines Pulses wird, desto größer ist die Bandbreite. Dies ist wichtig, da Breitbandpulse ein Phänomen zeigen, das als Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) bekannt ist, wenn sie durch ein komplexes optisches System wie ein Multiphotonenmikroskop geleitet werden. Dieser Effekt zweiter Ordnung wird durch den unterschiedlichen Brechungsindex eines optischen Materials für verschiedene Wellenlängen verursacht und bedeutet, dass sich der rötere Teil des Spektrums schneller durch ein Medium bewegt als der blauere Teil, wodurch der Puls effektiv verlängert wird. Solche Pulse werden als positiv gechirpt bezeichnet. Je größer die Bandbreite des Pulses ist, desto länger wird der Puls.

Die erste Generation automatisierter Laser, die speziell für die Multiphotonenmikroskopie entwickelt wurden (Chameleon XR), arbeitete mit einer Pulsdauer, die auf die typische GDD von Mikroskopsystemen zugeschnitten war, einschließlich einer komplexen Objektivlinse, eines Modulators und einiger anderer reflektierender Elemente. Abbildung 2 zeigt, dass eine Pulsbreite von etwa 140 fs nahe am Optimum für eine breite Palette von Mikroskop-GDDs liegt.

Die GDD eines Mikroskopsystems hängt stark von der Wellenlänge ab und ist typischerweise bei kürzeren Wellenlängen viel höher als bei Wellenlängen über 1.000 nm. Die Gesamt-GDD eines Systems ist das Produkt von GVD (Gruppengeschwindigkeitsdispersion) und der Länge des Materials. Typische GVD-Daten finden Sie in Abbildung 3. Beachten Sie die hohe Wirkung von TeO2, dem am häufigsten in akusto-optischen Modulatoren verwendeten Material. 

Bescheiden komplexe Mikroskope haben eine Gesamt-GDD von unter 8000 fs2 für Wellenlängen über 1.050 nm, daher ist die Pulsverbreiterung nur bei den allerkürzesten Pulsen ein großes Problem. Tatsächlich wird sich eine Pulsbreite von 200 fs auf 1.100 m unter solchen Bedingungen nur auf ~230 fs ausdehnen.

Bei der Auswahl eines Lasers mit oder ohne Dispersionskompensation gibt es praktische Überlegungen. Zu den Überlegungen gehören die folgenden: 

• Der Laser ist komplexer und größer. Auf Prismen basierende Kompressoren verlängern die optische Weglänge einer Laserleistung um mindestens 2–3 Meter und trotz eleganter Strahlfaltungstechnik verlängert der Vorkompensationsabschnitt normalerweise die Laserlänge um etwa 30 cm. 
• Die Prismen selbst fügen dem Strahl auch eine gewisse Wellenfrontverzerrung hinzu, was wiederum zu Astigmatismus im Strahl führt. Dies kann möglicherweise Auswirkungen auf die Punktverteilungsfunktion eines Bildes haben. Bewährte Verfahren im Laserbauprozess und -design kompensieren solche Effekte ebenfalls. 
• Durch die Prismen kommt es zu einem gewissen Übertragungsverlust. Typische Wirkungsgrade liegen je nach Wellenlänge zwischen 80 und 90 %. Bei Anwendungen, die eine sehr hohe Durchschnittsleistung erfordern, kann dies ein wichtiger Gesichtspunkt sein. 
• Es ist wichtig, die richtige Kurve für die jeweilige Mikroskopkonfiguration einzustellen; andernfalls besteht die Möglichkeit, dass der Probe unbeabsichtigt längere statt kürzere Pulse zugeführt werden. 

Im Allgemeinen profitieren Laser mit Pulsen <100 fs von der Dispersionskompensation in allen außer den einfachsten optischen Lieferketten. Tatsächlich könnte man fast sagen, dass solche Laser diese Einrichtung benötigen. Bei Lasern mit Pulsen in der Größenordnung von 140 fs überwiegen die Vorteile möglicherweise nicht immer die zusätzlichen Kosten und Größenauswirkungen der Vorkompensationsstufe. Es kann jedoch zu einer größeren Flexibilität bei der Verwendung für eine Vielzahl von Probentypen führen. 

Bei der Auswahl eines Ti:S-Lasers mit Dispersionskompensation und sehr kurzen Pulsen in der Größenordnung von 70–80 fs ist die korrekte Einstellung der Vorkompensationsprismen besonders wichtig. In regelmäßigeren Abständen kann ein ordnungsgemäßer Laserbetrieb und eine ordnungsgemäße Optimierung erforderlich sein, siehe Abbildung 6 als Beispiel.

Wie kurz ist zu kurz?

Angesichts des Markterfolgs von Ti:S-Lasern mit automatischer Dispersionskompensation könnte man sich fragen, warum man den Laserpuls nicht so kurz wie möglich machen sollte. Es gibt einige wichtige Einschränkungen, die den Erfolg solcher Unternehmungen einschränken. 

Bei abstimmbaren Lasern führen Einschränkungen des Optikdesigns zu einem Kompromiss zwischen Durchschnittsleistung und Abstimmbereich. Beispielsweise kann ein Ti:S-Laser mit 140 fs von 680 nm auf 1080 nm abgestimmt werden. Ein 75-fs-Puls kann aufgrund seiner inhärent größeren Bandbreite nicht so nah an den Rändern des Fluoreszenzemissionsspektrums von Ti:S abstimmen und ist daher auf ~1.050 nm begrenzt. Dies kann für Benutzer wichtig sein, die rot fluoreszierende Proteine ​​wie mCherry abbilden möchten. Wenn das Laserspektrum außerdem 100 nm überschreitet, neigt seine Form dazu, von einer glatten Gauß-Verteilung abzuweichen, was zu einer suboptimalen tatsächlichen Anregung bei einigen Spektralkomponenten führt.

Die größere Bandbreite sehr kurzer Impulse sollte auch im Hintergrund des abgebildeten Fluoreszenzmarkers berücksichtigt werden. Zwei-Photonen-Querschnitte sind zwar normalerweise breiter als ihre Einzelphotonen-Gegenstücke, betragen jedoch normalerweise <100 nm, und darüber hinaus kann der Querschnitt von der tatsächlichen Pulsbreite abhängen [13, 14]. Ultrabreitbandpulse werden häufiger eingesetzt, um viele Sonden gleichzeitig anzuregen, als um einen einzelnen Marker anzusprechen. Mögliche Ausnahmen sind die Mikroskopie zur Erzeugung harmonischer Schwingungen, bei der die Phasenanpassung relativ wellenlängenunabhängig ist, oder die Anregung von Quantenpunkten, da diese Sonden eine Bandbreite von Hunderten von Nanometern aufweisen. In diesen Fällen führt die Verwendung sehr kurzer Impulse zu einem hohen Signal, dennoch wurden Impulse unter 50 fs in MPE nur sporadisch eingesetzt. 

Bisher konzentrierten sich die Dispersionsdiskussionen nur auf Dispersionseffekte zweiter Ordnung. Die Dispersion dritter Ordnung (TOD) kann auch für Pulse mit ultrabreiter Bandbreite auf komplizierteren Mikroskopsystemen in Betracht gezogen werden. Dies ist die Frequenzabhängigkeit vom GDD und wird in Einheiten von fs3 ausgedrückt. TOD ist schwieriger zu modellieren als GDD und kann nicht allein mit Prismen vorkompensiert werden. Die Diskussion dieses Effekts geht über unseren derzeitigen Zweck hinaus, aber als allgemeine Richtlinie benötigen Laser mit Pulsen von etwa 30 fs oder weniger (oder Pulsen mit äquivalenter Bandbreite) ein komplizierteres System zur Phasensteuerung der Pulse für eine effiziente Multiphotonenanregung [15].

Zusammenfassung

Nahezu jede nichtlineare Mikroskopieanwendung von allgemeinem Interesse, einschließlich Optogenetik und Physiologie für die In-vivo-Neurowissenschaften, kann mit Femtosekundenpulsen im Bereich von 50–200 fs (von der Laserquelle) angegangen werden. Laserquellen, die Impulse unter ~100 fs erzeugen, profitieren von der Verwendung der Vorkompensation, um Anregungsverluste aufgrund einer Verschlechterung der Spitzenleistung zu vermeiden. Bei Wellenlängen über 1 Mikrometer ist die Notwendigkeit einer Vorkompensation weniger streng, da die GDD aller optischen Materialien bei längeren Wellenlängen stark abnimmt. Unabhängig von der verwendeten Wellenlänge führt eine Erhöhung der Durchschnittsleistung und/oder Spitzenleistung letztendlich zu linearen (thermischen) bzw. nichtlinearen Schäden. Es besteht ein Kompromiss zwischen den beiden Schadensarten, der jedoch von Probe zu Probe und auch in Abhängigkeit von der Wellenlänge unterschiedlich ist. Es hängt auch vom Zeitrahmen der experimentellen Beobachtung ab. Im Allgemeinen erhöht die Möglichkeit, auf höhere Spitzenleistungen auf der Probenebene zuzugreifen, die Flexibilität und die Fähigkeit, mehr Fluoreszenz in Proben anzuregen, die eine hohe lineare Absorption aufweisen und daher anfälliger für thermische Schäden sind. Darüber hinaus bringt die Hinzufügung der GDD-Vorkompensation für Benutzer sehr komplexer optischer Mikroskope mit hoher Dispersion Vorteile bei der Bildhelligkeit, was die zusätzlichen Kosten und die Komplexität des Lasers durchaus rechtfertigen kann.