백서

THz-Raman 정량 분석의 제약 응용 분야

개요

THz-Raman™ 분광법(저주파 라만이라고도 함)은 기존 라만에 의해 수집되는 200~1800cm-1에서의 화학적 지문 영역뿐만 아니라 0~200cm-1 범위에서의 진동 감지를 기반으로 합니다. 일반적으로 NIR 또는 FTIR과 같은 광학 분광 기법과 관련된 사용 용이성, 원격 감지, 직접 측정 등의 모든 이점과 더불어 구조 및 위상에 대한 실시간 샘플 정보를 제공하는 강력한 정량 분석 방식으로 최근 부상하고 있습니다. 이러한 구조 및 위상 정보는 제약 응용 분야에서 특히 중요할 수 있습니다. 이전에는 번거로운 샘플 조제와 더 복잡한 오프라인 방법(예: 분말 X선 회절(PXRD))이 필요했었습니다. THz-Raman 시스템은 이제 독립형 기기로 사용하거나 기존의 전통적인 라만 기기와 통합하여 저파수 영역에서 감도를 높일 수 있습니다. 또한 샘플 바이알용 탁상형 기기로서, 그리고 현미경 액세서리로서 침지 프로브와 함께 사용할 수 있으며 고속 대량 스크리닝 응용 분야를 위한 웰 플레이트 판독기에 통합됩니다. 제약 산업의 경우 수많은 응용 분야가 있지만, 본 백서에서는 제약에서의 광범위한 THz-Raman 실용성을 강조하기 위해 선택한 몇 가지 대표적인 응용 분야를 살펴봅니다.

다형체 식별

많은 활성 제약 성분(API)은 여러 형태 또는 다형체로 결정화될 수 있습니다. 이는 다양한 다형체가 위장관에서 상당히 다른 용해 특성을 가질 수 있는 난용성 약물에서 특히 중요한데, 그 이유는 생체 이용률 및 그에 따른 효능에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 예전에는 많은 약물의 다형성이 우연히 또는 시간이 많이 걸리는 수동적인 방법을 통해 검출되었습니다. 오늘날에는 결합 화학 및 고속 대량 스크리닝을 통한 약물 결정 공학을 이용해 안정적인 다형 형태 및/또는 수화물/무수 형태를 쉽고 철저하게 식별할 수 있습니다. 이는 개발, 제조 및 품질 보증 과정에서 신속하고 신뢰할 수 있는 다형체 식별이 의약품 제조에서 매우 중요하다는 것을 의미합니다.

다형체는 동일한 분자 구성을 가지고 있지만 분자가 결정 격자에 채워지는 방식만 다릅니다. 따라서 전통적인 광학 분석 방법으로는 여러 다른 다형체를 식별하는 것이 무척 어렵습니다. 예를 들어 FTIR, NIR 및 기존 라만 분석은 모두 분자 구성을 나타내는 분자 내 진동으로 인한 스펙트럼 피크 측정을 기반으로 합니다. 그래서 다형체 분석 응용 분야는 채취한 샘플의 조제와 복잡한 계측이 요구되는 분말 X선 회절(PXRD) 또는 고체 상태 NMR(ss-NMR)과 같은 다른 방법에 의존하는 경우가 많았습니다. THz-Raman은 샘플에서 저에너지 진동을 측정하고 이러한 진동 스펙트럼 피크는 주로 포논 모드 및 격자 진동과 같은 분자 간 진동에서 발생하기 때문에 이 응용 분야에 이상적인 것으로 나타났습니다. 따라서 THz-Raman 스펙트럼은 결정 형태의 미묘한 차이에도 매우 민감합니다. 또한 THz-Raman은 특별한 샘플 조제가 필요하지 않으므로 용제 사용을 줄이기 위한 친환경 화학 이니셔티브와 일치합니다.

그림 1: 뚜렷이 구별되는 피크를 보여주는 다양한 API의 다형체에 대한 THz-Raman 스펙트럼

예를 들어 Applied Spectroscopy의 한 논문[1]에서 Coherent(구 Ondax) 및 Bristol-Myers Squibb의 과학자들은 카르바마제핀(CBZ ), 카페인, 테오필린 및 아픽사반을 포함한 여러 공통적인 API에 대한 다형체 및 비정질 형태를 정량적으로 구별하기 위한 THz-Raman 분석의 성공적인 사용을 입증했습니다. 그리고 THz-Raman이 방향족 분자 구조에 대해 최대 약 130cm-1(4THz)의 예상 주파수 범위를 갖는 이른바 광학 포논을 감지한다고 설명했습니다. 또한 각 다형체가 격자 모드와 약간의 저주파(예: 비틀림) 분자 내 진동으로 구성된 특유한 THz-Raman 시그니처를 가지고 있음을 보여주었습니다. 

관련 연구에서 Coherent[2]의 과학자들은 인도메타신, 프로부콜 및 아세트아미노펜을 포함한 몇 가지 다른 API의 다형체 간의 뚜렷한 스펙트럼 구별을 입증했습니다(그림 1 참조). 또한 THz-Raman 시스템은 화학 물질 식별에 사용되는 고주파 라만 "화학적 지문" 영역을 완벽하게 보완하여 다형체를 빠르고 분명하게 구별할 수 있다고 요약했습니다.

 

공결정 형성

열 안정성, 용해율 등이 필수적인 API의 조제를 가능하게 하는 데 다형체를 최적화하는 것만으로는 항상 충분하지 않습니다. 따라서 제약 산업은 이러한 특성을 수정하기 위해 기타 다양한 접근 방식을 개발해 왔습니다. API의 용해성, 안정성 및 생체 이용률을 조절하기 위한 공결정 사용이 한 예입니다. 공결정은 두 가지 다른 분자 또는 이온 화합물 간의 수소 결합과 같은 약한 분자 간 상호 작용에 의해 형성된 분자 결정입니다. 또한 폭발물, 농약 및 안료에도 고려할 수 있습니다. 제약에서는 주로 저용해성 API에 사용됩니다.

공결정은 활성 제약 성분(API)과 이른바 공형성체로 구성됩니다. 여러 다른 화학량론을 기반으로 하는 동일한 API/공형성체 쌍으로 이루어진 다양한 공결정이 가능할 때가 많습니다. 예를 들어 카르바마제핀:4-아미노벤조산 공결정 시스템은 1:1, 2:1 및 4:1 화학량론적 조합으로 존재할 수 있으며, 각각은 특정 용해율 및 기타 중요한 물리화학적 특성을 가지고 있습니다. 공결정은 다양한 고체 상태, 슬러리 및 용액 기반 방법으로 형성할 수 있으며 공결정 조제는 여전히 활발한 연구 분야입니다.

따라서 특정 공결정을 정량적으로 식별할 수 있는 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 위해 QA, 스크리닝 및 진행 중인 모니터링을 통한 연구에서 공통적인 요구 사항이 있습니다. 전통적인 광학 방법은 공유 결합을 기반으로 하는 스펙트럼 피크에 중점을 두고 있으며 고작해야 공결정과 혼합물 간, 그리고 여러 다른 공결정 간의 미묘한 데이터 차이만 보여줄 수 있습니다. 분말 X선 회절(PXRD) 및 핵자기 공명(NMR) 분광법은 데이터를 제공할 수는 있지만 오프라인 측정을 위해 채취하여 조제된 샘플과 비용이 많이 소요되는 계측이 필요합니다. 그에 반해 THz-Raman은 주로 분자 간 진동과 격자 모드를 감지하는 광학 방법이므로 그림 2의 예에서 볼 수 있듯이 이러한 분석 과제에 매우 적합합니다.

그림 2: 카페인 및 2-벤조산의 1:1 공결정과 이 두 가지 화학 물질의 단순한 혼합물 간에 뚜렷한 차이를 보여주는 THz-Raman 스펙트럼

Industrial & Engineering Chemistry Research의 한 논문[3]에서 Coherent(구 Ondax), 메이지 약과 대학(도쿄도 기요세 소재) 및 일본 국립 보건 과학 연구소(도쿄도 세타가야 소재)의 과학자들은 THz-Raman 분광계가 공결정의 형성을 정량적으로 모니터링할 수 있음을 보여주었습니다. 구체적으로 말하면, 에탄올을 용제로 사용한 반응 결정화법(RCM)에 의해 형성된 카르바마제핀과 4-아미노벤조산의 1:1 및 2:1 공결정을 연구했습니다. 다변량 곡선 분해능(MCR)을 기반으로 한 데이터 피팅과 함께 침지 프로브에 파이버로 결합된 분광계를 사용하여 실시간으로 THz-Raman 데이터를 얻었습니다. 정량적 샘플 분석 외에도 이 기법을 사용하여 여러 다른 화학량론을 가진 공결정 간의 변환을 추적하고 반응 속도와 끝점까지의 시간을 알아낼 수 있음을 보여줌으로써 공결정화 공정에 유용한 실시간 공정 분석 도구로서의 THz-Raman 실용성을 입증했습니다.

그림 3: THz-Raman 스펙트럼 데이터의 MCR 피팅을 기반으로 카르바마제핀과 4-아미노벤조산의 1:1 공결정이 2:1 공결정으로 변환되는 것을 실시간으로 모니터링 (허가를 받아 [3]에서 재현했습니다.)

결정도 및 비정질 모니터링

저주파 라만 스펙트럼은 결정 격자 모드 및 광학 포논으로 인한 뾰족한 피크가 지배적이며, 이는 THz-Raman 분석기가 위상 혼합에서 특정 결정의 농도를 측정할 수 있음을 의미합니다(즉, "결정도 모니터"로 작동함)[4]. 결정 식별의 절대 표준은 물질의 격자 특성에 따라 특정 회절 각도에서 밝은 점 패턴의 형태로 데이터를 생성하는 분말 X선 회절(PXRD)입니다. 하지만 비정질 물질은 분자의 반 무작위적이고 무질서한 방향으로 인해 회절된 X선의 넓은 후광을 생성하며, 이는 잡음층 역할을 하고 감지 한계(LOD)를 설정합니다. 즉, 결정도 함량이 약 5% 미만일 때 PXRD를 통해 결정도 함량을 안정적으로 측정하는 것은 일반적으로 불가능합니다.

그림 4: 만니톨에 함유된 아세트아미노펜의 5가지 다른 중량 대 중량으로 측정된 혼합물에 대한 THz-라만 스펙트럼: 강조 표시된 영역은 아세트아미노펜 신호가 강한 영역과 함량 계산에 사용된 만니톨과의 중첩이 낮은 영역을 보여줍니다.

한편, THz-Raman 분광법을 사용하면 결정 성분으로 인한 뾰족한 피크들 중 일부는 낮은 농도에서도 여전히 명확하게 구별할 수 있습니다. 여기서, 배경 물질로 인해 스펙트럼 특징과의 중첩이 최소화되면서 대상으로 인해 스펙트럼 구성 요소 선택에 따라 LOD가 달라집니다. 그림 4는 만니톨에 희석된 아세트아미노펜 혼합물에 대한 최근 연구에서의 THz-Raman 스펙트럼을 보여줍니다. 강조 표시된 주파수 영역은 만니톨로 인한 신호와 아세트아미노펜 신호의 낮은 중첩을 기반으로 피팅을 위해 선택되었습니다. 물질 간의 밀도 차이를 고려하고 배경 제거 및 기준선 수정을 수행한 후, 예측된(중량 대 중량) 농도는 이 스펙트럼 창에 걸쳐 통합된 잔류 신호의 크기를 기반으로 계산되었습니다.

그림 5는 5가지 다른 농도에 대해 이 간단한 계산을 사용하여 계산된 농도 대 실제 농도의 플롯을 보여줍니다. 이 플롯을 기반으로 LOD는 약 1%로 측정되었으며 샘플 혼합물의 국소적인 공간적 변형으로 인해, 그리고 분석된 영역의 스펙트럼 시그니처 간의 어느 정도 남아 있는 중첩에도 불구하고 저농도에서 더 높은 오차가 발생했습니다. 이는 PXRD의 일반적인 LOD보다 훨씬 낮고 고체 상태 NMR(ss-NMR)과 유사합니다. 스펙트럼 피크 간에 더 나은 혼합물 균일성 또는 분리를 가진 다양한 물질 조합은 훨씬 더 낮은 LOD를 갖습니다.

그림 5: 만니톨에 함유된 다양한 아세트아미노펜 혼합물에 대해 측정된 농도 대 예측된 농도의 플롯

Coherent THz-Raman 분광법 응용 연구실에서 보유하고 있는 다른 시스템에서 얻은 데이터는 일부 공정 모니터링 사례의 경우 더 간단한 분석으로도 결정화도를 정량화하기에 충분할 수 있음을 보여주고 있습니다. 구체적으로 말하면, 결정 피크는 비정질 배경의 광범위한 보손 특징에 비해 전반적으로 뾰족하기 때문에 저주파 영역의 평균 스펙트럼 도함수(기울기)의 분석에서 결정화도의 근사치를 계산할 수 있는 경우가 많습니다.

실험실과 온라인 모두에서 실시간으로 결정도를 측정할 수 있는 기술은 제약 및 화학 산업의 여러 분야에 걸쳐 광범위하게 적용할 수 있으므로 분명한 장점입니다.

다중 수화물(의사 다형성)

의사 다형성이란 결정 격자에 포함된 용제 물질의 양에 따라 달라지는 동일한 화합물의 결정 위상을 말합니다. 예를 들어 수성 혼합물의 경우 반수화물, 일수화물, 이수화물 및 삼수화물 위상과 이러한 수화물의 혼합물 형태를 취합니다. 또 다른 발표된 연구[5]에서 Coherent(구 Ondax), 메이지 약과 대학(도쿄도 기요세 소재) 및 일본 국립 보건 과학 연구소(도쿄도 세타가야 소재)의 과학자들은 스테아린산마그네슘(Mg-St)의 고체 샘플에서 다양한 수화물 양을 측정하기 위한 THz-Raman 분광법 기술을 입증했습니다. 또한 이전 연구에서는 분말 윤활, 치밀화 및 유동성이 Mg-St의 일수화물 및 이수화물 형태에 대해 모두 다르다는 것을 보여주었다고 언급했습니다. 아울러 마그네슘 염의 식별, 가스 크로마토그래피에 의한 스테아르산의 상대적 함량 및 수분 함량이 Mg-St의 의사 다형성을 고유하게 결정하기에는 충분하지 않다는 점도 언급했습니다. 이러한 불확실성은 글로벌 기업이 다양한 수준의 우수한 제조 관행을 갖춘 여러 다른 지역에서 원료를 공급받는 경우 점점 문제가 될 수 있습니다.

이 연구에서는 여러 다른 공급업체로부터 획득한 10개의 Mg-St 샘플을 열무게 측정 및 시차열 분석(TGDTA)뿐만 아니라 PXRD로 분석하여 수화물 유형별로 설명했습니다. 고주파에서 기존 (화학적 지문) 라만은 수화물 간에 아주 작은 차이를 보였습니다. 하지만 그림 6처럼 Mg-St의 각 의사 다형성이 저주파 영역을 이용해 측정되었을 때 30 및 60cm−1 간, 그리고 100 및 180cm−1 간의 피크에 차이가 있었습니다. 특히, 각 수화물 스펙트럼에서의 피크가 100 및 180 cm−1 간의 영역에서 뚜렷하게 구분되었기 때문에 Mg-St가 의사 다형체의 혼합물이였던 경우에도 일수화물과 기타 수화물의 구별이 가능했습니다.

그림 6: 개별적으로 공급받은 몇 가지 Mg-St 샘플에 대한 정규화된 THz-Raman 스펙트럼의 확대도: 118cm-1에서 녹색 피크는 삼수화물의 존재로 인한 것이며 129cm-1에서 검정색 피크는 이수화물과 관련이 있습니다. (허가를 받아 [5]에서 재현했습니다.)

고속 대량 스크리닝

앞서 살펴보았던 응용 분야는 THz-Raman 분광법이 샘플의 평균 위상을 신속하게 알아내는 데 있어서 PXRD 및 ss-NMR 대신 사용할 수 있는 편리하고 간단한 대안임을 강조하고 있습니다. 다소 번거로운 구식 기법들 중 어느 것도 공간 매핑을 수행할 수 없습니다. 그에 반해서 대물 렌즈를 통해 라만 및 THz-Raman 측정을 수행하는 기술은 샘플링 영역의 조정(확대/축소) 및 스캔을 모두 지원하므로 구성 및 구조/위상 모두에 대해 현미경으로 샘플을 고유하게 매핑(이미징)할 수 있습니다. 이 이미징 기능은 또한 고속 대량 스크리닝(HTS) 응용 분야를 위한 웰 플레이트의 매핑과 웰 내 매핑을 가능하게 합니다. Coherent는 6~1536 웰의 가장 일반적인 웰 플레이트 형식에 대한 턴키 분석을 지원하기 위해 완전 자동화된 웰 플레이트 판독기인 TR-WPS를 제공하고 있습니다[6].

그림 7: 주성분 분석(PCA) 및 클러스터링을 기반으로 이 맵을 생성하는 데 사용된 3개의 API 및 해당 THz-Raman 스펙트럼에 대해 동시에 매핑된 Excedrin 테이블

그림 7은 Coherent 응용 실험실에서 TR-WPS의 간단한 시연을 통해 얻은 가색상 데이터를 보여줍니다. 구체적으로 말하면, Excedrin® 정제 하나가 한 웰에 배치되었고 27,000개가 넘는 스펙트럼 데이터 포인트가 9분 동안 정제의 직경 3.5mm 영역에 걸쳐 수집되었습니다. 주성분 분석(PCA) 및 클러스터링을 사용하여 세 가지 구성 화합물(아세트아미노펜, 아스피린 및 카페인)과 경계 영역의 혼합물을 식별했습니다. 이 영역에 대한 편광 현미경(PLM) 이미지를 동시에 촬영한 다음 시각적 비교를 위해 라만 맵과 오버레이했습니다. 해당 스펙트럼은 물질 또는 다형체를 신속하게 식별 및 구별하고 시각적 데이터와 스펙트럼 데이터를 모두 캡처할 수 있는 TR-WPS의 성능을 입증하는 확실한 크기의 고품질 데이터를 명확하게 보여줍니다.

® Excedrin은 GlaxoSmithKline의 등록 상표입니다.

 

요약

THz-Raman 분광법을 사용하면 샘플에 대한 실시간 비접촉 분석이 가능하므로 구조적 정보를 얻을 수 있습니다. 그 외 다른 방법을 사용하는 경우에는 PXRD 및 ss-NMR과 같은 다루기 힘든 처리 기법을 이용한 샘플 조제 및 오프라인 측정이 필요합니다. 기존 라만과 원활하게 통합되어 샘플에 대한 구성과 구조를 모두 동시에 조사할 수 있기 때문에 때 특히 유용합니다. 몇 가지 제약 응용 분야에 대한 이러한 조사는 고분자 과학, 반도체 물질 및 산업 화학 물질을 비롯한 수많은 다른 산업에도 바로 적용할 수 있는 이점과 더불어 잠재적인 용도의 폭을 보여주고 있습니다.

 

참고 문헌

     

    1. P.J. Larkin 외, 저주파 라만 분광법을 이용한 활성 제약 성분(API)의 다형체 특성화, Applied Spectroscopy, Vol 68, Number 7, 2014년

    2. Coherent, Inc., 의약품에서의 다형체 식별, Application Highlights, 2019년

    3. M. Inoue 외, 프로브 유형 저주파 라만 분광법을 이용해 여러 다른 화학량론이 포함된 공결정 형성 실시간 모니터링, Industrial & Engineering Chemistry Research, Vol, 56, #44, 12693~12697, 2017년

    4. J. Wallace, 결정도 위상 모니터로 적합한 THz-Raman 계측, Laser Focus World, 6, 2020년

    5. T. Koide 외, 저주파 라만 분광법을 이용해 스테아린산마그네슘의 의사 다형성 식별, Organic Process Research & Development, Vol 20, 1906~1910, 2016년

    6. Coherent, Inc., THz-Raman을 사용한 고속 대량 스크리닝, Application Highlights, 2020년

     

귀사의 문제 해결을 돕기 위해 무료 상담을 예약하십시오.