기사
이테르븀 파이버 레이저를 통한
최첨단 신경 과학 지원
새로운 기능과 향상된 사용 편의성 기능을 갖춘 초고속 소스
개요
쥐 기반 신경 과학 연구는 다광자 현미경의 주요 응용 분야를 나타냅니다. 이 기사에서는 몇 가지 흥미로운 조사 영역을 검토하여 해당 분야를 엿볼 수 있습니다. 피질 신경망이 뇌 조직의 표면 아래에서 작동하는 방식을 이해하기 위한 연구의 일환으로 적색 편이 기능 프로브가 개발되었습니다. 이 프로브는 더 깊이 침투하는 긴(즉, >1미크론) 레이저 파장과 함께 사용됩니다. 최근에는 광자가 부족한 초심도 이미지를 위한 대규모 광유전학적 광활성화 및 3광자 여기에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 티타늄 사파이어 레이저는 이러한 요구를 쉽게 충족할 수 없기 때문에 레이저 제조업체들은 몇 가지 장점, 특히 출력 확장 및 반복률 민첩성을 제공하는 이테르븀 첨가 파이버 레이저 엔진으로 눈을 돌렸습니다.
그림 1: 살아있는 뇌 조직에서 초고속 레이저의 침투 깊이는 산란과 흡수의 조합에 의해 제한됩니다. 1,300nm 및 1,700nm에 중심을 둔 두 개의 최적 침투 창이 있습니다. 코넬 대학교의 Chris Xu 교수와의 비공개 커뮤니케이션을 기반으로 합니다.
이테르븀 파이버 레이저
이테르븀 파이버 레이저는 약 1,040nm에서 고정 파장 출력을 제공하며, 광 매개변수 장치를 사용하여 근적외선을 조정합니다. 일반적으로 이광자 이미징에 사용되는 80MHz의 반복률에서 광 매개변수 발진기(OPO)는 레이저 헤드 내에서 사용되어 광범위한 파장 조정(660nm~1,320nm)을 제공합니다. 이를 통해 단파장 및 적색 편이 형광 프로브 및 단백질 모두의 효율적인 이광자 여기를 수행할 수 있습니다. 이 유형의 원박스 소스의 또 다른 중요한 이점은 사용자가 두 가지 출력 파장 (1,040nm에서 고정 Yb 출력 및 광유전학 실험 및 기타 유형의 "이중 파장" 실험을 위한 조정 가능한 OPO 출력)에 액세스할 수 있다는 것입니다. 출력은 일반적으로 각 채널에서 1~3W입니다.
티타늄 사파이어와 달리 이테르븀 파이버는 쉽게 출력 확장이 가능하여 대규모 뉴런 집단을 자극하는 데 적합한 매우 유연한 반복률(최대 10MHz 대)을 가진 증폭기를 만들 수 있습니다. 3광자 이미징과 같이 고출력 및 파장 조정이 필요한 응용 분야는 광 매개변수 증폭기(OPA)를 추가하여 충족됩니다. 최근의 몇 가지 발전 사항에서는 신경 과학계의 변화하는 요구와 함께 레이저 기술의 융합을 강조하고 있습니다. 아래에 몇 가지가 설명되어 있습니다.
이테르븀의 장점
티타늄 사파이어와 달리 이테르븀 파이버는 쉽게 출력 확장이 가능하여 대규모 뉴런 집단을 자극하는 데 적합한 매우 유연한 반복률(최대 10MHz 대)을 가진 증폭기를 만들 수 있습니다.
더 깊은 3광자 이미징
신경과학에서 가장 중요한 주제는 해마까지의 마우스 피질의 전체(>1mm) 깊이를 이미징하는 것입니다. 레이저 침투 및 형광 신호 검색이 최대화되는 두 개의 광범위한 적외선 "창"이 1.3µm 및 1.7µm에 있습니다(그림 1). 다행히 1.3µm 창은 녹색 형광 단백질을 기반으로 하는 3광자 여기 프로브에 적합하며 1.7µm 창은 Tdtomato와 같은 적색 형광 단백질을 기반으로 하는 프로브에 적합합니다. 또한 이러한 파장은 얇은 뼈를 통해 상당히 잘 침투하여 경우에 따라 유리 두개골 창이 필요하지 않습니다.
이러한 파장에서 제공되는 3광자 이미징은 이제 조정 가능한 광 매개변수 증폭기를 펌핑하는 이테르븀 파이버 증폭기에 의해 활성화됩니다. 기존 OPA의 경우 내부 아키텍처는 짧은 펄스 또는 넓은 파장 조정에 최적화되어 있습니다. 그러나 3광자 이미징에서는 이상적으로 둘 다 필요합니다. 따라서 이 용도를 위해 설계된 최신 OPA는 비공선형 단계에서 짧은 펄스(50~70fs로 압축 가능)를 생성한 다음 동일선형 단계에서 매우 광범위한 파장 조정을 제공하는 하이브리드 설계를 사용했습니다.
Allen Institute(워싱턴주 시애틀)의 Jack Waters가 이끄는 팀은 이러한 유형의 증폭기와 OPA로 이러한 방식으로 3광자 이미징을 수행하면서 마우스 피질이 시각적 자극에 의해 유발된 신경 조절 신호를 처리하는 방법을 관찰했습니다. Waters의 목표는 가능한 한 많은 피질을 조사하는 것이었습니다. 1,300nm 레이저 광은 쥐의 두개골을 통해 상당히 잘 전달되므로 피질의 넓은 영역에 유리창과 냉각 이미지가 필요하지 않습니다. 이 팀의 연구 데이터는 그림 2에 나와 있습니다.
대규모 뉴런 집단에서의 Ca2+ 활동 모니터링
이 유형의 OPA에 대한 최대 펄스 반복률은 현재 2MHz입니다. 예를 들어 일부 응용 분야에서는 목표 뇌 부피의 모든 뉴런 또는 적어도 여러 보기 평면의 모든 뉴런 신호를 모니터링(Ca2+ 활동 측정을 통해)하기 위해 훨씬 더 높은 반복률이 필요합니다. 대규모 뉴런 집단을 실시간으로 이미징하려면 감소된 체류 시간을 보상하기 위해 더 높은 전력과 함께 더 빠른 스캔이 꼭 필요합니다.
Aliphasha Vaziri와 여러 미국 및 유럽 연구소의 공동 작업자가 작성한 최근 논문에서는 단일 뉴런 해상도를 유지하면서 이러한 유형의 대규모 모니터링을 실현하는 새로운 방법을 성공적으로 보여 주었습니다[1]. 연구원들은 920nm 펄스를 사용하여 몇 가지 기발한 혁신을 통해 일반적인 칼슘 지표인 GCAMP6m의 이광자 여기를 수행했습니다. 초점을 맞춘 빔 웨이스트를 단일 뉴런의 일반적인 치수와 일치시키기 위해 시간 초점(TeFo)과 기존 초점의 조합을 사용했습니다. 많은 양의 뉴런을 모니터링하기 위해 복셀당 하나의 레이저 펄스(즉, 뉴런당 하나의 펄스)를 목표로 하는 스마트 스캐닝을 사용하기로 결정했습니다. 따라서 높은 펄스 에너지가 필요했습니다. 또한 이 연구원들은 다중 헤르츠(3~160Hz) 보기 속도에 도달하기 위해 4MHz보다 높은 펄스 반복률이 필요했습니다. OPA는 아직 이 반복률에 도달하지 않았기 때문에 이테르븀 파이버 증폭기를 사용하여 광 매개변수 처프 펄스 증폭기(OPCPA)라고 하는 조정 가능한 차세대 초고속 장치를 펌핑했습니다. 이 장치는 최대 몇 MHz의 출력 속도를 제공하며 효과적인 처프 오프셋으로 조정됩니다. 또한 이 유형의 OPCPA는 이제 이테르븀 파이버 증폭기가 소형 헤드와 완전히 통합된 단일 상자 제품으로 제공됩니다.
그림 2: 쥐의 손상되지 않은 두개골을 통한 칼슘 이미징 관련 Allen Institute 이미지. (A) 아크릴 또는 커버슬립이 없는 준비 도식. (B) Emx1-IRES-Cre, - CaMk2a-tTA, Ai94 쥐의 시간 평균 투영. 10Hz 프레임 속도. ~300µm 두께의 무손상 두개골을 통해 1,300nm에서 3P 여기. 현미경은 파이아 아래 450µm에 초점을 맞췄습니다. (C) GCaMP 발현 체세포에서 나타나는 자발적인 칼슘 과도 현상(패널 B의 원). 여기 소스: Coherent(Monaco) 증폭기와 Coherent(Opera) OPA.
그림 3: 빠른 프레임 속도 칼슘 이미징의 예. 1,040nm에서 여기된 RCaMP1.07을 발현하는 뉴런, 생체 내, 쥐. 여기 소스: Chameleon Discovery TPC. 취리히 대학교 Weber Lab 제공.
대규모 뉴런 집단의 광활성화
뉴런에서 발현되는 옵신 단백질의 이광자 흡수(즉, 다광자 광유전학)는 단일 뉴런 해상도에서 뉴런의 활성화 및/또는 침묵을 수행하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이는 다광자 칼슘 이미징과 결합되어 단일 뉴런 해상도(때로는 "전광학 생리학"이라고도 함)에서 신경망을 여기하고 모니터링할 수 있습니다. 광유전학의 최초 개척자인 Karl Deisseroth는 또한 이광자의 광유전학적 자극 및 침묵을 개발하는 데 앞장서고 있습니다. 스탠포드 대학교에 소속된 그의 그룹은 이를 위해 이광자 여기를 사용하는 선두주자입니다.
여기서도 문제는 출력과 속도입니다. 그러나 이테르븀 증폭기의 1,035nm 출력은 어떤 유형의 조정 가능한 광 매개변수 장치도 필요 없이 단파장 옵신의 이광자 여기를 수행하는 데 가장 적합합니다. 그리고 고속(0.4~50MHz)은 가장 빠른 실험도 지원합니다. Deisseroth 연구소의 Jim Marshel은 다음과 같이 말합니다. "10MHz는 만성적이고 장기적인 연구에서 수십에서 수백 개의 뉴런을 효율적으로 광활성화할 수 있는 최적의 펄스 속도인 것 같습니다. 최신 이테르븀 파이버 증폭기의 고출력과 고속 펄스는 이 용도에 적합합니다."
직접 레이저 출력 변조
신경과학의 발전은 첨단 연구를 위한 새로운 증폭기 재료와 새로운 매개변수 장치 아키텍처에 의해 지원될 뿐만 아니라 기존의 주류 이광자 이미징 응용 분야도 실용적인 구현에 대한 새로운 접근 방식의 혜택을 받고 있습니다. 이러한 경우의 예는 레이저 발진기에서 확인할 수 있는데, 여기서 완전한 다광자 현미경의 중요한 부분은 현미경 스캔 헤드의 상부에서 레이저 출력을 제어하는 기술입니다. 이 기능은 간단한 래스터 스캔 실험에서도 최적의 성능을 위한 요구 사항입니다. 현미경 스캔 헤드가 다음 y 스캔을 위해 빔 스팟(플라이백)을 반환하므로 레이저 출력을 완전히 차단해야 합니다. 또한 큰 z 스택을 스캔하는 용도에 중요한 기능입니다. 시스템이 조직 깊숙이 초점을 맞추면 자연 감쇠로 인해 일정한 이미지 강도를 유지하기 위해 더 높은 레이저 출력을 사용해야 합니다. 그리고 점점 더 정교해지는 고속 스캐닝 프로토콜에서 출력 제어를 사용하여 복셀 체류 시간과 관련된 최적의 전력 수준을 유지할 수 있습니다.
고속 출력 제어는 OEM 현미경 제조업체와 자체 다광자 현미경을 구축하는 대다수의 사용자 모두에게 어려운 과제임이 입증되었습니다. 특히 펄스 폭을 과도하게 늘리거나(처핑) 고해상도 이미지에 필요한 원형 가우스 빔의 품질을 손상시키지 않고 실시간으로 빔 출력을 조정하는 방법이 그러합니다.
최신 이테르븀 기반 레이저는 이제 펄스 폭과 TEM00 빔 품질(M2 < 1.1)을 보장하면서 조정 가능한 빔과 고정 파장 빔이 레이저 헤드를 떠나기 전에 완전히 독립적으로 제어할 수 있습니다. 음향 광학 변조기(AOM)는 자체 제작한 현미경에 적합한 0-10V 아날로그 입력 또는 AOM에 직접 RF 입력을 통해 활용하고 외부에서 제어하여 OEM 현미경 제조업체의 비용과 복잡성을 최소화할 수 있습니다. 고속 전력 변조의 이점을 얻는 응용 분야는 빠른 프레임 속도 칼슘 이미징입니다(그림 3).
요약
레이저 기술의 보완적 발전과 함께 분자 프로브 및 이미징 방법의 급속한 발전으로 다광자 현미경이 최고 수준의 성능을 발휘하고 있습니다. 신경과학자들은 뇌의 신비를 계속 밝혀 내면서 이러한 발전을 이용하여 이미지 해상도, 깊이 및 기능 범위에 대한 최첨단 기술을 향상시키고 있습니다.
"10MHz는 만성적이고 장기적인 연구에서 수십에서 수백 개의 뉴런을 효율적으로 광활성화할 수 있는 최적의 펄스 속도인 것 같습니다. 최신 이테르븀 파이버 증폭기의 고출력과 고속 펄스는 이 용도에 적합합니다."
-Jim Marshel - 신경과학자, 스탠포드 의과대학 - Deisseroth Lab
소속
1. Darryl McCoy, Coherent UK Ltd., 영국 글래스고
2. Marco Arrigoni, Coherent, Inc., 미국 캘리포니아주 산타클라라