백서
비선형 현미경의 피크 출력: 미사여구 정확히 들여다보기
다광자 여기(MPE) 현미경 덕분에 생물학 연구실에서 펨토초 레이저는 현재 20년 이상 사용되어 왔습니다. 손상이 적은 생체 내 이미징과 호환되는 다양한 프로브 및 레이저 출력의 여기를 위해 필요한 파장 범위가 잘 확립되어 있습니다. 그러나 적절한 펄스 지속 시간은 여전히 논의 대상이자 개인 선호와 다양한 실험 조건을 따릅니다. 이 백서는 비선형 이미징 애플리케이션을 위한 펨토초 펄스 전파 및 관리에 대한 유용한 정보를 제공합니다.
소개
Denk 등의 선구적인 업적 이후 2광자 레이저 스캐닝 형광 현미경에서는 비선형 이미징과 전용 초고속 레이저의 채택이 크게 확대되었습니다[1]. 동시에 레이저 기술의 기능, 유용성 및 유연성도 크게 향상되었습니다.
초기 작업이 복잡한 색소레이저 기술에 의해 지배되었던 반면, Ti:Sapphire(Ti:S) 레이저, 파이버 레이저 및 OPO 시스템은 이제 비레이저 전문가가 사용하기 쉬운 턴키 형식으로 다양한 옵션을 제공합니다.
다광자 형광자 여기 또는 광 활성화를 위한 레이저 기술을 선택할 때는 여러 가지 주요 기술적 고려 사항이 존재합니다. 특정 파장 또는 파장 범위를 선택하는 것은 대상 형광 프로브의 잘 문서화된 여기 단면 스펙트럼에 의해 구동되는 비교적 간단한 프로세스입니다. 더욱 어려운 것은 최적의 출력 또는 최대 출력 체제를 선택하는 것입니다.
이러한 어려움의 이유는 여러 가지인데 주로 샘플 손상과 형광 강도 및 평균 출력, 피크 출력 그리고 파장 간의 상호 작용 때문입니다. 문제를 더욱 복잡하게 만드는 것은 문헌에서 수행된 MPE가 파장은 680~1,300nm, 펄스는 5fs에서1~2ps, 수십 피코줄과 마이크로줄 사이의 샘플 에너지/펄스라는 것을 확인할 수 있습니다. 또한 최신 레이저는 현미경 시스템의 광학 트레인에서 선형 분산을 사전 보상하여 샘플 평면에서 바로 이러한 짧은 펄스를 전달할 수 있는 기능을 갖추고 있습니다. 결과적으로 선택은 약간 애매하고 개인적 선호가 반영될 여지가 있으며, 종종 과거 경험에 따라 결정되어 새로운 실험에 적용되거나 적용되지 않을 수 있습니다. 이 백서의 목표는 Coherent Chameleon 제품군과 관련된 애플리케이션에서 가져온 데이터 포인트를 기반으로 몇 가지 지침을 제공하는 것입니다.
배경: 비선형 형광자 여기
우리는 먼저 독자가 생물학적 시료의 다광자 여기의 원리와 장점에 대한 기본 배경 지식을 가지고 있다고 가정합니다. 단일 펄스의 경우 순간 피크 출력이 높을수록 2(또는 그 이상)의 광자 흡수 확률이 더 커진다고 말할 수 있습니다. 이렇게 되면 더 많은 형광자 여기가 발생하므로 더 많은 방출을 감지할 수 있습니다.
레이저 펄스의 피크 출력은 정확한 시간적 프로파일 펄스에 엄격하게 의존하지만 일반적으로 다음과 같이 기록됩니다.
레이저의 펄스 에너지는 다음과 같습니다.
Pav 레이저의 평균 출력, F는 펄스 반복률을 나타내고, Tp는 FWHM 펄스 지속 시간을 나타냅니다.
여기되는 프로브의 형광자 수명이 상대적으로 짧은 레이저 스캐닝 현미경의 경우 시간 평균 방출은 이러한 펄스가 샘플에 전달될 수 있는 속도에 따라 달라집니다. 이를 위해 총 형광자 수율은 다음과 같이 레이저의 시간 평균 출력과 피크 출력의 곱으로 작성할 수 있습니다.
평균 출력, 펄스 폭, 반복률 등 상용 레이저 시스템의 데이터시트에서 일반적으로 볼 수 있는 매개변수로 이를 표시하는 것이 도움이 됩니다. 따라서 다음과 같습니다.
여기에서는 샘플의 형광자를 증가시키기 위해 어떤 레이저 매개변수를 조정할 수 있는지 확인하는 것이 상대적으로 간단합니다. 문제는 샘플 생존 가능성, 기술적 유용성 및/또는 비용에 대한 타협 없이 이러한 모든 매개 변수를 자유롭게 조정할 수는 없다는 것입니다. 이제 여기에 따른 장단점을 별도로 살펴보겠습니다.
다광자 현미경의 광손상
공초점 이미징의 광독성 및 선형 광손상에 대한 많은 참고 자료와 논문에도 불구하고 생체 내 및 체외 MPE 방법과 시료 유형에 대한 이러한 역학을 탐구하는 표적화되고 체계적이며 정량적 연구는 상대적으로 적습니다.
Hell et al.[2] 및 Koenig[3]에서 몇 가지 훌륭한 통찰력과 배경을 얻을 수 있습니다. 이 섹션의 논의 대부분은 Hell[2], Piston[4], Neher[5]가 이끄는 그룹의 주요 작업과 Cheng et al.[6, 7]의 사진 표백 메커니즘에 대한 이론적 분석에서 파생되었습니다. 레이저 손상의 잘 알려진 원인은 광열 상호 작용입니다. 이는 초고속 레이저원이나 기타 CW 또는 펄스 레이저원의 기본 파장의 선형 흡수를 통해 발생합니다. 선형 흡수는 사용된 샘플 유형 및 파장에 따라 크게 달라지지만 순간 피크 출력과 관련된 영향은 없고 샘플이 흡수하는 평균 출력에만 관련됩니다. 예를 들어, 대부분의 생물학적 샘플에서 주로 사용되는 물은 근적외선에서 특정 흡수선을 가지며 일반적으로 1350nm 이상의 파장을 사용할 때 흡수가 더욱 중요하게 됩니다. 샘플에 미치는 영향에는 국지적인 가열과 궁극적으로 샘플 내 물의 끓음으로 인한 캐비테이션이 포함됩니다. 그러나 캐비테이션이 발생하기 훨씬 전에, 즉 국지적 온도 상승이 세포 생존 한계를 초과하는 경우 손상이 발생할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. Hellet al.[8]은 선형 수분 흡수에 의해서만 결정된 샘플의 온도 상승에 대해 간단하지만 설득력 있는 평가를 수행했습니다. 그들은 MPE에 사용되는 일반적인 평균 출력(초점면에서 ~100mW)이 1°C 미만의 온도 상승을 결정한다는 것을 보여 주었으며 이러한 샘플에서 MPE에 필요한 레이저 출력으로 인한 열 손상은 문제가 되지 않는다는 결론을 내렸습니다. 그러나 헤모글로빈이나 멜라닌과 같이 다른 종으로 인해 강한 흡수가 존재하는 경우 샘플 온도가 훨씬 더 급격하게 상승할 수 있다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 인간 피부에서 2P 빛 침투는 종종 멜라닌 흡수에 의해 제한됩니다[9]. 선형 효과만 있는 경우 펄스 지속 시간을 줄이고 비선형 여기에 유익한 피크 출력을 증가시켜 이러한 효과를 최소화할 수 있습니다.
광표백은 형광자 자체의 분해로 인해 시료의 형광자 방출이 급격히 감소하는 메커니즘입니다. 광손상이라는 단어는 광퇴색이 빛으로 인한 손상의 주요 원인임을 나타내는 데 사용되는 경우가 많지만 장기적으로 다른 메커니즘이 발생할 수도 있습니다. 이러한 메커니즘은 광표백과 관련된 화학적 변화에 의해 촉발될 수 있지만 광표백 자체의 기간(몇 초 또는 수십 초)보다 더 오랜 시간 동안 발생할 수 있습니다. 광표백의 메커니즘은 복잡하며 다양한 측면에서 활발한 연구 대상입니다. 광표백은 1광자 및 2광자 여기에서 모두 발생하지만 2광자 여기의 경우 초점면에 국한됩니다. 펨토초 펄스가 있는 경우 광표백은 2보다 높은 출력으로 증가할 수 있으며 이는 2광자 및 3광자 프로세스의 혼합 또는 더 높은 차수 프로세스를 나타냅니다[4, 5]. 광표백의 더 높은 비선형성에 대한 간단한 설명이 그림 1에 나와 있습니다. 여기서 색소(또는 형광 단백질) 분자는 2광자 흡수에 의해 첫 번째 단일항 상태 S1로 여기됩니다. 추가 광자와 상호 작용하면 프로세스 kb를 통해 분자가 훨씬 더 높은 상태로 여기되어 분자가 해리될 수 있습니다. 대안적으로, 단일항 상태 여기는 시스템 간 교차를 통해 삼중항 상태 T1으로 전달될 수 있으며 이 상태는 ko를 통해 에너지를 단일항 산소 상태로 전달할 수 있습니다.
시스템 간 교차 확률과는 별도로, 특히 높은 피크 출력에서 MPE의 더 큰 광자 플럭스는 매우 비선형적인 항으로 이어지는 3- 또는 4-광자 상호 작용의 확률을 증가시킬 것이 분명합니다.
요약하자면, 생물학적 표본에서 레이저 출력을 높이면 결국 선형(물 및 기타 구성 요소에 의한 흡수) 및 비선형(2P 흡수로 인해 1개 이상의 광자 흡수가 추가로 발생하여 광표백이 발생함)일 수 있는 광손상이 발생합니다. MPE 현미경의 열 손상은 펄스 지속 시간(따라서 평균 출력)을 줄임으로써 감소할 수 있지만 결과적으로 피크 출력이 증가하면 비선형 광표백이나 다른 형태의 손상이 발생할 수 있습니다. 그러면 열 손상 감소와 비선형 효과 시작 사이에 균형이 이루어져야 합니다.
손상은 파장에 따라 달라집니다. 700-800nm에서 900-1,100nm, 심지어 1,250nm까지 여기 파장의 증가가 샘플 생존 가능성에 도움이 된다는 사실이 여러 연구에서 나타났습니다. 물론 모든 프로브가 긴 파장으로 여기될 수 있는 것은 아니지만 가능할 때마다 여기 스펙트럼의 빨간색 면에 있는 형광단을 여기시키는 것이 유리한 것 같습니다. 이는 파장이 길수록 산란이 적어 더 깊은 이미징에도 도움이 되기 때문에 유용합니다. 더 좋은 점은 다음 섹션에서 설명하는 것처럼 파장이 길수록 분산에 대한 내성이 더 강하다는 것입니다. 이러한 모든 요소로 인해 MPE는 더 안전한 920-1,100nm 영역에서 여기될 수 있는 프로브를 채택하게 되었습니다.
더 긴 파장에 대한 평가는 만장일치인 것처럼 보이지만 이상적인 펄스 지속 시간의 선택은 여전히 더 주관적이거나 심지어 관념적입니다. 더 논의하기 전에 현미경 시스템의 짧은 펄스 관리를 검토하는 것이 유용합니다.
그림 1: [7]에서 채택된 고차 비선형 상호작용을 통한 광표백 메커니즘
펨토초 펄스 전파 관리
특정 시간적 FWHM 폭의 Ultrafast 레이저 펄스는 시간적 펄스 형태에 따라 결정되는 고유한 최소 주파수 대역폭을 갖습니다. 상업용 Ti:S 레이저의 일반적인 초시컨트 모양 펄스(sech2)의 경우 이는 다음과 같이 제공됩니다.
또는 파장 측면에서 다음과 같습니다.
0.315의 시간-대역폭 곱을 갖는 Sech2 펄스는 변형 제한적이라고도 합니다. 예를 들어, 변환이 제한된 800nm, 100fs 펄스의 대역폭은 6.725nm입니다. 실제로 완벽한 펄스를 달성하는 것은 매우 어렵고 Ti:S 레이저의 경우 대역폭은 일반적으로 변환 한계보다 1.1-1.3 배 더 높습니다.
펄스의 폭이 짧아질수록 대역폭은 커집니다. 이는 광대역 펄스가 다광자 현미경과 같은 복잡한 광학 시스템을 통과할 때 그룹 지연 분산(GDD)이라는 현상을 나타내기 때문에 중요합니다. 다양한 파장에 대한 광학 소재의 굴절률 차이로 인해 발생하는 이 2차 효과는 스펙트럼의 빨간색 부분이 파란색 부분보다 빠르게 매질을 통과하여 펄스를 효과적으로 연장한다는 것을 의미합니다. 이러한 펄스를 포지티브 처프(Positive Chirped)라고 합니다. 펄스의 대역폭이 클수록 펄스의 길이가 길어집니다.
다광자 현미경(Chameleon XR)용으로 특별히 설계된 1세대 자동 레이저는 복잡한 대물렌즈, 변조기 및 기타 몇 가지 반사 요소를 포함하여 현미경 시스템의 일반적인 GDD에 맞게 조정된 펄스 지속 시간으로 작동합니다. 그림 2는 약 140fs의 펄스폭이 광범위한 현미경 GDD에 대한 최적에 얼마나 가까운지를 보여줍니다.
그림 2: 다양한 입력 펄스 지속 시간과 현미경 복잡성에 대한 펄스 확장. 이는 최대 140fs의 펄스가 가장 광범위한 조건에서 샘플에 가장 짧은 펄스를 전달하는 방법을 보여줍니다.
현미경 시스템의 GDD는 파장에 크게 의존하며 일반적으로 1000nm 이상의 파장보다 짧은 파장에서 훨씬 더 높습니다. 시스템의 총 GDD는 재료의 길이에 GVD(군 속도 분산)를 곱한 것입니다. 일반적인 GVD 데이터는 그림 3을 참조하세요. 음향광학 변조기에 사용되는 가장 일반적인 재료인 TeO2의 높은 효과에 주목하십시오.
적당히 복잡한 현미경은 1050nm 이상의 파장에 대해 총 GDD가 8000fs2 미만이므로 펄스 확장은 가장 짧은 펄스를 제외한 모든 경우에 큰 문제가 되지 않습니다. 실제로 1100m에서 200fs의 펄스폭은 이러한 조건에서 ~230fs까지만 늘어납니다.
그림 3: 상업용 2P 현미경에 사용되는 일반적인 광학 재료에 대한 GVD입니다.
펨토초 레이저의 GDD 사전 보상
그림 2에서는 총 GDD가 8000fs2보다 상당히 높을 때 120fs 미만의 펄스로 샘플 평면의 펄스 폭이 어떻게 극적으로 증가할 수 있는지 분명합니다. 이는 변조기(AOM 또는 EOM)가 현미경 시스템에 포함되어 있을 때 매우 일반적이며 대부분의 상용 MPE 현미경에서 일반적으로 발생합니다.
이 효과를 피하기 위한 노력의 일환으로 숙련된 최종 사용자와 레이저 회사는 광학 시스템에 입력하기 전에 펄스에 음의 처프를 추가하여 2차 GDD를 사전 보상하는 방법을 성공적으로 고안했습니다[10]. 이는 그림 4에 예시된 것처럼 평균 레이저 출력을 일정하게 유지하면서 이미지 밝기에 뚜렷한 영향을 미칠 수 있습니다.
GDD 사전 보상의 실제 구현은 사용되는 파장이 고정되어 있고 음의 처프의 양이나 변동성이 제한되어 있는 한 처프 미러[11]를 사용하여 수행할 수 있습니다. 그러나 일반적인 상용 조정 가능 Ti:S 레이저 시스템은 이제 프리즘 쌍 압축기를 기반으로 하는 분산 보상을 사용할 수 있습니다[12]. 프리즘 스테이지를 모터화하여 시스템을 완전히 자동화할 수 있습니다.
사용자는 그림 5에 표시된 것처럼 선택한 파장에 대해 샘플 평면의 펄스 폭을 최소화할 수 있도록 특정 현미경에 맞게 GDD 곡선을 설정할 수 있습니다.
펄스폭을 동적으로 변경하는 기능은 피크 출력 최대화를 포함하는 이점을 가질 수 있으며, 어떤 경우에는 광독성으로 인한 손상이 우려되는 경우 펄스폭을 늘리는 것이 바람직할 수 있습니다. 연구에 따르면 처프(즉, 늘어난) 펄스는 이러한 손상을 최소화하는 효과적인 방법이 될 수 있습니다[2].
그림 4: 분산 보상을 통해 이미지 밝기를 증가시킨 예. 레이저 출력과 감지 게인은 일정하게 유지되지만 A에 대한 GDD 설정은 다양합니다. 0fs2, B:10000fs2 및 C: 15000fs2. Grenoble Institute of Neuroscience에서 제공한 CY3 표지 Glial 세포의 840nm 이미징.
그림 5: 분산 보상 Ti:S 레이저에 대한 음의 GDD 곡선. 파란색 선 아래의 모든 값은 사용자 정의된 사용자 곡선으로 프로그래밍될 수 있습니다.
분산 보상이 있거나 없는 레이저를 선택할 때 실제적인 고려 사항이 있습니다. 이 고려 사항은 다음과 같습니다.
- 레이저가 더 복잡하고 더 큽니다. 프리즘 기반 압축기는 레이저 출력에 최소 2~3미터의 광학 경로 길이를 추가하며 우아한 빔 폴딩 엔지니어링에도 불구하고 일반적으로 사전 보상 섹션은 레이저 길이에 ~30cm를 추가합니다.
- 프리즘 자체도 빔에 일정량의 파면 왜곡을 추가하며, 이는 결국 빔에 난시를 추가합니다. 이는 잠재적으로 이미지의 점 확산 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 레이저 제작 프로세스 및 설계의 모범 사례도 이러한 효과를 보상합니다.
- 프리즘을 통해 약간의 전송 손실이 있습니다. 일반적으로 효율성은 파장에 따라 80~90% 사이입니다. 매우 높은 평균 출력이 필요한 애플리케이션의 경우 이는 중요한 고려 사항이 될 수 있습니다.
- 특정 현미경 구성에 대해 올바른 곡선을 설정하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 샘플에 더 짧은 펄스가 아닌 더 긴 펄스를 의도치 않게 전달하는 것이 가능할 수 있습니다.
일반적으로 펄스가 100fs 미만인 레이저는 가장 단순한 광학 전달 열차를 제외한 모든 부분에서 분산 보상의 이점을 얻습니다. 사실, 그러한 레이저에는 이 시설이 필요하다고까지 말할 수도 있습니다. 140fs 정도의 펄스를 사용하는 레이저의 경우 이점이 항상 사전 보상 단계의 추가 비용 및 크기 영향보다 크지 않을 수 있습니다. 그러나 이는 다양한 시료 유형에 대해 더 큰 유연성을 제공할 수 있습니다.
분산 보상과 70-80fs 정도의 매우 짧은 펄스를 모두 갖춘 Ti:S 레이저를 선택하는 경우 사전 보상 프리즘을 올바르게 설정하는 것이 특히 중요합니다. 보다 정기적인 간격으로 적절한 레이저 작동 및 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들어 그림 6을 참조하십시오.
그림 6: 일반적인 Ti:S 레이저 펄스에 대한 GDD 설정의 감도입니다. 펄스가 짧을수록 최상의 성능을 보장하기 위해 GDD 설정에 더 많은 주의가 필요합니다.
얼마나 짧아야 너무 짧은 것일까요?
자동화된 분산 보상 기능을 갖춘 Ti:S 레이저의 시장 성공을 고려하면 레이저 펄스를 가능한 한 짧게 만드는 것이 어떨까요? 그러한 모험의 성공을 제한하는 데에는 몇 가지 중요한 제한 사항이 있습니다.
조정 가능한 레이저의 범위 내에서 광학 설계의 한계는 평균 출력과 조정 범위에서 상충 관계가 있음을 의미합니다. 예를 들어, 140fs의 Ti:S 레이저는 680nm에서 1080nm까지 조정할 수 있습니다. 75fs 펄스는 본질적으로 더 넓은 대역폭으로 인해 Ti:S의 형광자 방출 스펙트럼 가장자리에 너무 가깝게 조정할 수 없으므로 약 1050nm로 제한됩니다. 이는 mCherry와 같은 적색 형광 단백질을 이미지화하려는 사용자에게 중요할 수 있습니다. 또한 레이저 스펙트럼이 100nm를 초과하면 그 모양이 부드러운 가우스 분포에서 벗어나는 경향이 있어 일부 스펙트럼 구성 요소에서 실제 여기가 최적이 아닌 결과를 낳습니다.
이미지화되는 형광 마커를 배경으로 매우 짧은 펄스의 더 넓은 대역폭도 고려해야 합니다. 2광자 단면은 일반적으로 단일 광자 단면보다 넓지만 일반적으로 100nm 미만이며 단면은 실제 펄스 폭에 따라 달라질 수 있습니다[13, 14]. 초광대역 펄스는 개별 마커를 처리하기보다는 동시에 많은 프로브를 여기하기 위해 더 일반적으로 사용되었습니다. 위상 정합이 상대적으로 파장에 독립적인 고조파 생성 현미경이나 해당 프로브가 수백 나노미터의 대역폭을 표시하는 양자점의 여기는 예외입니다. 이러한 경우 매우 짧은 펄스를 사용하면 높은 신호가 발생하지만 MPE의 50fs 미만 펄스는 산발적으로만 채택되었습니다.
지금까지의 분산 논의는 2차 분산 효과에만 초점을 맞춰왔습니다. 3차 분산(TOD)은 보다 복잡한 현미경 시스템의 초광대역 펄스에 대해 고려할 수도 있습니다. 이는 GDD에 대한 주파수 의존성이며 fs3 단위로 표현됩니다. TOD는 GDD보다 모델링하기 어렵고 프리즘만으로는 사전 보상할 수 없습니다. 이 효과에 대한 논의는 현재 목적을 벗어나지만 일반적으로 약 30fs 이하의 펄스(또는 등가 대역폭의 펄스)를 갖는 레이저는 효율적인 다광자 여기를 위해 펄스의 위상 제어를 위한 보다 복잡한 시스템이 필요합니다[15].
요약
생체 내 신경과학을 위한 광유전학 및 생리학을 포함하여 일반적인 관심을 끄는 거의 모든 비선형 현미경 응용 분야는 (레이저 소스에서) 50-200fs 범위의 펨토초 펄스로 처리될 수 있습니다. 약 100fs 미만의 펄스를 생성하는 레이저 소스는 피크 출력 저하로 인한 여기 손실을 방지하기 위해 사전 보상을 사용하면 이점을 얻을 수 있습니다. 모든 광학 재료의 GDD가 더 긴 파장에서 크게 감소하기 때문에 사전 보상의 필요성은 1미크론 이상의 파장에서는 덜 엄격합니다. 사용되는 파장에 관계없이 평균 출력 및/또는 피크 출력을 증가시키면 궁극적으로 각각 선형(열) 또는 비선형 손상이 발생합니다. 두 가지 유형의 손상 사이에는 균형이 존재하지만 샘플마다 다르며 파장의 함수로도 다릅니다. 또한 실험 관찰의 시간 규모에 따라 달라집니다. 일반적으로 샘플 평면에서 더 높은 피크 출력에 접근할 수 있는 능력은 선형 흡수가 높은 샘플에서 더 많은 형광을 여기시킬 수 있는 유연성과 기능을 추가하므로 열 손상에 더 취약합니다. 또한, 분산이 매우 복잡한 광학 현미경 사용자의 경우 GDD 사전 보상을 추가하면 이미지 밝기의 이점을 얻을 수 있으며, 이는 레이저에 추가되는 비용과 복잡성을 정당화할 수 있습니다.