非線形顕微鏡におけるピークパワー：レトリックの解明

P_avはレーザの平均出力、Fはパルス繰り返し周波数、T_pはFWHMパルス幅をそれぞれ表します。

レーザ走査型顕微鏡の場合、励起されるプローブの蛍光寿命が比較的短いため、時間平均発光は、パルスが試料に到達する速度にも依存します。この目的を達成するために、総蛍光収量は、次のようにレーザの時間平均出力とピークパワーの積として次のように表すことができます。

ここから、試料からの蛍光を増やすためにどのレーザパラメータを調整できるかを確認するのは比較的簡単です。問題は、試料の生存能力、技術的有用性、コストを犠牲にすることなく、これらのパラメータすべてを自由に調整できるわけではないことです。これらのトレードオフを個別に検討します。

マルチフォトン顕微鏡における光ダメージ

共焦点イメージングにおける光毒性と線形光ダメージに関する多くの文献や論文があるにもかかわらず、生体内および体外のMPE法と試料の種類を対象とした、これらの動態に関する系統的かつ定量的な研究はまだ比較的少数です。 

Hellら [2] とKoenig [3] から、いくつかの優れた洞察と背景を得ることができます。このセクションの議論の大部分は、Hell [2]、Piston [4]、Neher [5] を中心とするグループによる主要な研究と、Chengらによる光白化メカニズムの理論的解析 [6、7] に基づいています。レーザダメージの原因として確立されているのは、光熱相互作用です。これは、ウルトラファーストレーザ光源、またはその他のCWレーザ光源やパルス発振レーザ光源の基本波長の線吸収によって起こります。線吸収は試料の種類と使用する波長に大きく依存しますが、試料が吸収する平均出力にのみ関係し、瞬間的なピークパワーには関係しません。たとえば、ほとんどの生体試料の大部分を占める水は、近赤外域に特異的な吸収線を持っており、一般的に1350 nm以上の波長を使用すると、その吸収が顕著になります。試料への影響としては、局所的な加熱があり、最終的には試料内の水が沸騰してキャビテーションが発生します。しかし、キャビテーションが発生するかなり前、つまり局所的な温度上昇が細胞の生存可能性の限界を超えた時点でダメージが発生する可能性があることに留意する必要があります。Hellら [8] は、線形吸水率のみによって決定される試験片の温度上昇について、単純だが説得力のある評価を行いました。彼らは、MPEで使用される典型的な平均出力（焦点面上で～100 mW）が1°C未満の温度上昇を決定することを示し、これらの試料ではMPEに必要なレーザ出力による熱ダメージは問題ではないと結論付けました。ただし、ヘモグロビンやメラニンのような他の化学種による強い吸収が存在する場合、試料の温度はより劇的に上昇する可能性があることを認識することが重要です。たとえば、人の皮膚では、2P光透過はメラニンの吸収によって制限されることがよくあります [9]。線形効果のみが存在する場合は、パルス幅を短くし、非線形励起に有効なピークパワーを増加させることで、これらの影響を最小限に抑えることができます。

光退色は、蛍光種自体の劣化により試料の蛍光発光が急速に減少するメカニズムです。多くの場合、光ダメージという言葉は、光によるダメージの主な原因として光退色を示すために使われますが、より長期的に起こるメカニズムは他にもある可能性があります。これらのメカニズムは、光退色に関連する化学変化によって引き起こされる可能性がありますが、光退色自体のタイムスケール（数秒から数十秒）よりも長い時間にわたって起こる可能性があります。光退色のメカニズムは複雑で、様々な側面から活発に研究されています。光退色は1光子励起と2光子励起の両方で起こりますが、2光子励起の場合は焦点面に限定されます。フェムト秒パルスが存在する場合、光退色は2以上の出力で増加することが知られており、これは2光子と3光子の混合プロセス、またはさらに高次のプロセスであることを示しています [4、5]。光退色におけるより高い非線形性の簡単な説明を図1に示します。ここでは、色素（または蛍光タンパク質）分子は、2光子吸収によって最初の一重項状態S1に励起されます。追加の光子との相互作用により、図に示すプロセスkbを介して分子がさらに高次の状態に励起され、分子の解離が起こることがあります。あるいは、一重項状態励起は項間交差を介して三重項状態T1に移行することができ、この状態はk_oを介してそのエネルギーを一重項酸素状態に伝達することができます。

項間交差の確率とは無関係に、MPEでは光子束が大きくなると、特にピークパワーが高いとき、3光子または4光子の相互作用の確率が増加して高度な非線形項につながることは明らかです。 

要約すると、生物学的試料上でレーザ出力を増加させた場合、最終的に線形（水や他の成分による吸収）または非線形（2P吸収がさらに1光子吸収またはそれ以上の光子吸収を引き起こし、光退色をもたらす）の光ダメージが発生します。MPE顕微鏡における熱ダメージは、パルス幅（したがって平均出力）を短くすることで減少させることができますが、その結果、ピークパワーが増加すると、非線形光退色や他の形態のダメージが増加する可能性があります。したがって、熱ダメージの減少と非線形効果の発生との間にはトレードオフが存在する必要があります。

ダメージは波長にも依存します。多くの研究により、励起波長を700～800 nmから900～1,100 nmまで、さらに1,250 nmまで増加させると、試料の生存に有益であることが示されています。もちろん、すべてのプローブが長波長で励起できるわけではありませんが、可能な限り励起スペクトルの赤色側で蛍光色素分子を励起することが有利であると思われます。また、波長が長いほど散乱が少ないため、より深いイメージングにも有効です。さらに良いことに、次のセクションで説明するように、波長が長いほど分散の影響を受けにくくなります。これらすべての要素により、MPEをより安全な920～1,100 nm領域で励起できるプローブが採用されるようになりました。 

より長い波長に関する評価は一致しているように見えますが、理想的なパルス幅の選択は、より主観的、または観念的ですらあります。これ以上議論する前に、顕微鏡システムにおける短パルスの管理を復習しておくと有益です。

フェムト秒パルスの伝播の管理

特定の時間FWHM幅のウルトラファーストレーザパルスには、その時間パルス形状によって支配される固有の最小周波数バンド幅を持っています。市販のチタンファイアサファイアレーザに典型的なハイパーセカント形状（sech2型）のパルスの場合、次のようになります。

時間とバンド幅の積が0.315であるSech₂型のパルスは、変換限界であると言われています。たとえば、変換限界800 nm、100 fsのパルスのバンド幅は、6.725 nmになります。実際には、完全なパルスを達成するのは非常に難しく、チタンサファイアレーザのバンド幅は通常、変換限界の1.1～1.3倍です。

パルスの幅が短くなるほど、バンド幅は大きくなります。これは重要です。なぜなら、広バンド幅パルスは、多光子顕微鏡などの複雑な光学系を通過すると、群遅延分散（GDD）と呼ばれる現象が発生するためです。波長ごとに光学材料の屈折率が異なることによって引き起こされるこの2次効果は、スペクトルの赤い部分が青い部分よりも速く媒質を通過し、実質的にはパルスが長くなるということを意味します。このようなパルスは、ポジティブチャープと呼ばれます。パルスのバンド幅が大きいほど、パルスはより長くなります。

マルチフォトン顕微鏡用に特別に設計された自動化レーザの第1世代（Chameleon XR）は、複雑な対物レンズ、変調器、その他いくつかの反射素子を含む顕微鏡システムの典型的なGDDに合わせたパルス幅で動作しました。図2は、約140 fsのパルス幅が、広範な顕微鏡のGDDに対していかに最適に近いかを示しています。

顕微鏡システムの群遅延分散（GDD）は波長に強く依存しており、一般的に1000 nmを超える波長よりも短波長の方が、はるかに高くなります。システムの総GDDは、GVD（群速度分散）と材料の長さの積です。典型的なGVDデータについては、図3を参照してください。音響光学変調器で使用される最も一般的な材料である二酸化テルル（TeO2）の高い効果に注目してください。 

適度に複雑な顕微鏡では、1,050 nmを超える波長では総GDDが8,000 fs2未満です。したがって、非常に短いパルスを除いて、パルス広がりは強い懸念事項ではありません。実際、このような条件下では、1,100 mで200 fsのパルス幅は最大230 fsまで伸びるだけです。

分散補償の有無にかかわらず、レーザを選択する際には実用的な考慮事項があります。考慮すべき点は以下のとおりです。 

• レーザはより複雑で大型です。プリズムベースのコンプレッサーにより、レーザ出力に少なくとも2～3メートルの光路長が追加されます。エレガントなビーム折り畳み技術にもかかわらず、通常、前置補償部により、レーザの長さが最大30 cm長くなります。 
• プリズム自体もビームにある程度の波面歪みを加え、それによりビームに非点収差が加わります。これは、画像の点広がり関数に影響を与える可能性があります。レーザの構築プロセスと設計のベストプラクティスは、このような影響も補償します。 
• プリズムによる透過率損失が若干あります。通常、効率は波長に応じて80～90%です。非常に高い平均出力を必要とするアプリケーションでは、これは重要な考慮事項となる可能性があります。 
• 特定の顕微鏡構成に合わせて正しい曲線を設定することが重要です。そうでない場合、誤って短いパルスではなく長いパルスを試料に与えてしまう可能性があります。 

一般に、100 fs未満のパルスを持つレーザは、ごく単純な光伝送列を除き、分散補償の恩恵を受けることができます。実際、そのようなレーザにはこの機能が必要であると言えるでしょう。140 fs程度のパルスを持つレーザの場合、利点は前置補償ステージの余分なコストとサイズの影響を必ずしも上回らないかもしれません。ただし、これにより、様々な種類のサンプルをより柔軟に使用できる可能性があります。 

分散補償と70～80 fs程度の非常に短いパルスの両方を備えたチタンサファイアレーザを選択する場合、前置補償プリズムの適切な設定が特に重要です。より定期的な間隔で適切なレーザ操作と最適化が必要になる場合があります。例として図6を参照してください。

短すぎるとはどの程度の短さか？

自動分散補償を備えたチタンサファイアレーザの市場での成功を考えると、なぜレーザパルスをできるだけ短くしないのでしょうか？このようなベンチャーの成功には、いくつかの重要な制約があります。 

波長可変レーザの範囲では、光学設計の限界により、平均出力と波長可変領域はトレードオフの関係にあります。たとえば、140 fsのチタンサファイアレーザは、680 nmから1080 nmまで調整可能です。75 fsのパルスは本来バンド幅が広いため、チタンサファイアの蛍光発光スペクトルの端に近づけることができず、約1050 nmが限界です。これは、mCherryのような赤色蛍光タンパク質を画像化したいユーザーにとって重要です。さらに、レーザのスペクトルが100 nmを超えると、その形状が滑らかなガウス分布から乖離する傾向があり、その結果、一部のスペクトル成分において実際の励起が最適化されなくなります。

非常に短いパルスの広いバンド幅は、撮像される蛍光マーカーの背景でも考慮する必要があります。2光子の断面は、通常、対応する1光子の断面よりも広いですが、通常は100 nm未満であり、さらに、断面は実際のパルス幅に依存する可能性があります [13、14]。超広帯域パルスは、個々のマーカーに対応するためではなく、多くのプローブを同時に励起するために採用されるのが一般的です。例外として考えられるのは、フェーズマッチングが比較的波長に依存しない高調波発生顕微鏡や、数百ナノメートルのバンド幅を持つ量子ドットの励起です。このような場合、非常に短いパルスを使用することで高い信号が得られますが、MPEで50 fs以下のパルスは散発的に採用されているだけです。 

これまでの分散に関する議論は、2次の分散効果にのみ焦点を当ててきました。3次分散（TOD：Third-Order Dispersion）は、より複雑な顕微鏡システムで超広バンド幅パルスを使用する場合にも考慮されます。これはGDDに対する周波数依存性であり、fs3の単位で表されます。TODはGDDよりもモデル化が難しく、プリズムだけでは前置補償できません。この効果についての議論は今回の目的からは外れますが、一般的な指針として、約30 fs以下のパルス（または同等のバンド幅のパルス）を持つレーザでは、効率的な多光子励起のために、パルスの位相制御用のより複雑なシステムが必要になります [15]。

概要

生体内神経科学のためのオプトジェネティクスや生理学を含む、一般的に関心のあるほぼすべての非線形顕微鏡アプリケーションは（レーザ光源からの）50～200 fsの範囲のフェムト秒パルスで対応できます。約100 fs以下のパルスを生成するレーザ光源は、ピークパワーの劣化による励起の損失を避けるために、前置補償を使用する利点があります。すべての光学材料のGDDは、波長が長くなると強く低下するため、1ミクロン以上の波長では、前置補償の必要性はそれほど厳しくありません。使用する波長に関係なく、平均出力やピークパワーの増加は、最終的にそれぞれ線形（熱）または非線形ダメージをもたらします。2種類のダメージの間にトレードオフは存在しますが、試料によって、また波長の関数としても異なります。また、実験観察の時間スケールにも依存します。一般に、試料の面でより高いピークパワーを利用できるようになると、柔軟性が増し、線吸収が大きく熱損傷の影響を受けやすい試料でも、より多くの蛍光を励起できるようになります。さらに、高分散の光学顕微鏡を使っているユーザーにとっては、GDDの前置補償を加えることで、画像の輝度に関してメリットが生じます。これにより、レーザに加わるコストと複雑さを許容できるかもしれません。