白皮书
在非线性显微镜内的峰值功率：无夸大成分
多光子激发（MPE）显微镜将飞秒激光器引入生物研究实验室已有 20 多年的历史。各种探针的激发所需的波长范围以及与低损伤体内成像兼容的激光功率已经基本确定成型。然而，合适的脉冲宽度仍然是讨论的主题、影响着个人操作偏好，以及不同的实验条件下的变化。本白皮书提供了有关非线性成像应用的飞秒脉冲传输和管理的有用信息。
简介
由于 Denk 等人在双光子激光扫描荧光显微镜中的开创性成就，非线性成像和专用超快激光器的采用和结合已被大大扩展 [1]。同时，激光技术的能力、可用性和灵活性也显着增长。
最初的工作以复杂的染料激光器技术为主，而现在钛宝石（Ti:S）激光器、光纤激光器和 OPO 系统以交钥匙形式提供了大量选项，对于非激光专家来说也很容易使用。
选择用于多光子荧光激发或光激活的激光技术时，需要考虑许多关键的技术因素。选择特定波长或波长范围是一个相对简单的过程，由相关荧光探针的有据可查的激发截面光谱驱动。更困难的是选择最优功率或峰值功率状态。
造成这种困难的原因有很多，主要是因为样品损伤和荧光强度之间的相互作用，另一方面是平均功率、峰值功率和波长之间的相互作用。使问题进一步复杂化的是，在文献中可以发现，MPE 的波长为 680 至 1,300 nm，脉冲为 5 fs 至 1-2 ps，在样品处的脉冲能量为数十皮焦耳至微焦耳。此外，现代激光器能够通过对显微镜系统光学系统中的线性色散进行预补偿，将较短的脉冲输送到样品平面上。因此，在选择中存在一些模糊和个人偏好的空间，这通常是由过去的经验决定的，这些经验可能适用于也可能不适用于新的实验。本白皮书的目标是根据从 Coherent Chameleon 系列的应用中获取的数据，来提供一些相关的指南。
背景：非线性荧光激发
我们首先假设读者具有知晓生物样品多光子激发原理和优点的基本知识。可以说，对于单个脉冲，瞬时峰值功率越高，吸收 2 个（或更多）光子的概率就越大。随之而来的是会有更多的荧光激发，因此更多的发射可用于检测。
激光脉冲的峰值功率虽然严格取决于精确的时间轮廓脉冲，但通常写成：
其中，激光器的脉冲能量为：
Pav 为激光的平均功率，F 代表脉冲重复频率，Tp 代表 FWHM 脉冲持续时间。
对于激光扫描显微镜，被激发的探针具有相对较短的荧光寿命，时间平均发射也取决于这些脉冲传递到样品的速率。为此，总荧光收率可以写为激光器的时间平均功率和峰值功率的乘积，如下：
用商业激光系统数据表中常见的参数来表示这一点是有益的，例如平均功率、脉冲宽度和重复频率。因此：
从这里可以相对简单地看出可以调整哪些激光参数来增加样品的荧光。问题是，并非所有这些参数都可以在不影响样品可行性、技术可用性和/或成本的情况下自由调整。现在将单独探讨这些参数的权衡问题。
多光子显微成像的光损伤
尽管有许多关于共焦成像中光毒性和线性光损伤的参考文献和论文，但探索体内和体外 MPE 方法和样品类型的这些动力学的针对性、系统性和定量研究仍然相对较少。
一些出色的见解和背景可以参考 Hell et al. [2] 和 Koenig [3]。本节的大部分讨论源自 Hell [2]、Piston [4]、Neher [5] 领导的小组的关键工作，以及 Cheng 等人 [6,7] 对光漂白机制的理论分析。激光损伤的一个公认原因是光热相互作用。这通过超快激光源或任何其他连续波或脉冲激光源的基本波长的线性吸收而发生。线性吸收高度依赖于样品类型和所使用的波长，但仅与样品吸收的平均功率相关，而与瞬时峰值功率无关。例如，在大多数生物样品中占主导地位的水，在近红外光波段具有特定的吸收谱线，一般来说，当使用 1350 nm 以上的波长时，其吸收变得更加显着。对样品的影响包括局部加热，并最终使样品中的水沸腾，从而导致空化。然而，应该注意的是，损坏可能在空化发生之前发生，即当局部温度升高超过细胞活力的限度时。Hell 等人 [8] 对仅通过线性吸水率确定的样品温度升高进行了简单但令人信服的评估。他们表明，MPE 中使用的典型平均功率（焦平面上 ~ 100 mW）决定了温度升高 < 1°C，并得出结论，在这些样品中，由于 MPE 所需的激光功率而引起的热损伤不是问题。然而，重要的是要认识到，在血红蛋白或黑色素等其他物质存在强吸收的情况下，样品温度可能会急剧上升。例如，在人体皮肤中，2P 光穿透常常受到黑色素吸收的限制 [9]。在仅存在线性效应的情况下，可以通过减少脉冲持续时间并增加有利于非线性激励的峰值功率来最小化这些效应。
光漂白是一种由于荧光物质本身的降解而导致样品荧光发射快速减少的机制。通常，光损伤这个词被用来表示光漂白是光诱导损伤的主要原因，尽管从长远来看可能还有其他机制发生。这些机制可能是由与光漂白相关的化学变化触发的，但发生的时间可能比光漂白本身的时间尺度（几秒或几十秒）更长。光漂白的机制很复杂，在各个领域都被积极地研究。虽然光漂白在单光子和双光子激发下都会发生，但在双光子激发的情况下，它仅限于焦平面。人们已经认识到，在存在飞秒脉冲的情况下，光漂白可能会随着功率高于 2 而增加，意味着双光子和三光子过程的混合，甚至更高阶的过程 [4, 5]。图 1 显示了对光漂白的较高非线性的简单解释。这里，染料（或荧光蛋白）分子通过 双光子吸收被激发到第一单线态 S1；与额外光子的相互作用通过 kb 过程将分子激发到更高的状态，可能导致分子解离。或者，单线态激发可以通过系间窜越转移到三线态 T1，并且该状态可以通过 ko 将其能量转移到单线态氧态。
与系统间交叉的概率无关，很明显，MPE 中较大的光子通量，特别是在高峰值功率情况下，将增加三或四光子相互作用的概率，从而导致高度非线性项。
总而言之，增加生物样本上的激光功率最终会导致光损伤，这种损伤可以是线性的（被水和其他成分吸收）和非线性的（2P 吸收导致额外的 1 个或更多光子吸收，从而导致光漂白）。MPE 显微镜中的热损伤可以通过减少脉冲持续时间（因此减少平均功率）来减少，但由此产生的峰值功率增加可能会导致更高的非线性光漂白或其他形式的损伤。那么，必须在热损伤的减少和非线性效应的发生之间进行权衡。
损坏还取决于波长。大量研究表明，激发波长从 700-800 nm 增加到 900-1,100 nm 甚至 1,250 nm 有利于样品的生存力。当然，并非所有探针都可以用长波长激发，但只要有可能，在激发光谱的红色一侧激发荧光团似乎是有利的。这也是有用的，因为较长的波长经历较少的散射，因此也有利于更深的成像。更好的是，更长的波长更不受色散的影响，这将在下一节中讨论。所有这些因素都推动 MPE 采用可以在更安全的 920 - 1,100 nm 区域激发的探针。
虽然对较长波长的评估似乎是一致的，但理想脉冲持续时间的选择仍然更加主观，甚至是基本意识形态。在进一步讨论之前，回顾一下显微镜系统中短脉冲的管理非常有益。
图 1：通过高阶非线性相互作用的光漂白机制，改编自 [7]
管理飞秒脉冲的传输
特定时间 FWHM 宽度的超快激光脉冲具有固有的最小频率带宽，由其时间脉冲形状控制。对于商用 Ti:S 激光器典型的超割线形脉冲（sech2），见下式：
或者用波长来表示：
时间带宽积为 0.315 的 Sech2 脉冲称为变换受限脉冲。例如，变换限制的 800 nm、100 fs 脉冲的带宽为 6.725 nm。实际上，完美的脉冲很难实现，对于 Ti:S 激光器，带宽通常高于变换限度的 1.1-1.3 倍。
脉冲宽度越短，带宽就越大。这很重要，因为宽带宽脉冲在通过复杂的光学系统（例如多光子显微镜）时会表现出一种称为群延迟色散（GDD）的现象。由于光学材料对不同波长的折射率不同，这种二阶效应意味着光谱的红色部分比蓝色部分更快地穿过介质，从而有效地延长了脉冲。这种脉冲被称为正啁啾。脉冲的带宽越大，脉冲的长度就越长。
第一代专为多光子显微成像设计的自动化激光器（Chameleon XR），其运行脉冲持续时间围绕显微镜系统的典型 GDD 定制，包括复杂的物镜、调制器和一些其他反射元件。图 2 说明了约 140 fs 的脉冲宽度如何接近各种显微镜 GDD 的最优值。
图 2：针对不同输入脉冲持续时间和显微镜复杂性的脉冲展宽。它演示了约 140 fs 的脉冲如何在最广泛的条件下向样品提供最短的脉冲。
显微镜系统的 GDD 强烈依赖于波长，并且在较短波长下通常比在超过 1000 nm 的波长下高得多。系统的总 GDD 是 GVD（群速度色散）与材料长度的乘积。典型 GVD 数据见图 3。请注意 TeO2 的高效应，TeO2 是声光调制器中最常用的材料。
对于超过 1050 nm 的波长，中等复杂的显微镜的总 GDD 低于 8000 fs2，因此除了最短的脉冲之外，脉冲展宽并不是所有脉冲的重点关注点。事实上，在这种条件下，1100 m 处 200 fs 的脉冲宽度只会延伸到约 230 fs。
图 3：适用于商用 2P 显微镜中典型光学材料的 GVD。
飞秒激光器中 GDD 的预补偿
从图 2 清楚地表明，当总 GDD 远高于 8000 fs2 时，采样平面处的脉冲宽度如何在脉冲小于 120 fs 时急剧增加。当显微镜系统中包含调制器（AOM 或 EOM）时，这种情况很常见，这是大多数商用 MPE 显微镜的常见做法。
为了避免这种影响，熟练的最终用户和激光公司成功地设计了对二阶 GDD 进行预补偿的方法，即在输入光学系统之前向脉冲添加负啁啾 [10]。这会对图像亮度产生显着影响，同时保持平均激光功率恒定，如图 4 所示。
只要所使用的波长固定并且负啁啾的数量或变化受到限制，GDD 预补偿的实际实现就可以使用啁啾镜 [11] 来完成。然而，典型的商用可调谐 Ti:S 激光系统现在可提供基于棱镜对压缩器的色散补偿 [12]。该系统可以通过棱镜平台的机动化实现完全自动化。
如图 5 所示，用户可以设置适合其特定显微镜的 GDD 曲线，这样对于任何选定的波长，样品平面上的脉冲宽度都可以最小化。
动态改变脉冲宽度的能力可以带来好处，包括最大化峰值功率，并且在某些情况下，当担心光毒性造成损害时，可能需要增加脉冲宽度。研究表明，啁啾（即拉伸）脉冲可以是最大限度减少此类损害的有效方法 [2]。
图 4：通过色散补偿增加图像亮度的示例。激光功率和检测增益保持恒定，但 A 的 GDD 设置不同：0 fs2、B:10000 fs2 和 C：15000 fs2.CY3 标记的神经胶质细胞的 840 nm 成像由格勒诺布尔神经科学研究所提供。
图 5：色散补偿 Ti:S 激光器的负 GDD 曲线。蓝线以下的任何值都可以编程为自定义的用户曲线。
选择带或不带色散补偿的激光器时需要考虑实际情况。考虑因素包括：
- 激光器更复杂、体积更大。基于棱镜的压缩器为激光输出增加了至少 2-3 米的光路长度，尽管光束折叠工程设计精巧，但预补偿部分通常会增加约 30 厘米的激光长度。
- 棱镜本身也会给光束增加一定量的波前畸变，这反过来又会给光束增加像散。这可能会影响图像的点扩散函数。激光构建过程和设计的最优实践也弥补了这种影响。
- 通过棱镜的时候会存在一些传输损耗。通常效率在 80% 到 90% 之间，具体取决于波长。对于需要非常高平均功率的应用来说，这可能是一个重要的考虑因素。
- 为特定的显微镜配置设置正确的曲线非常重要；否则，可能会无意中向样品传递更长而不是更短的脉冲。
一般来说，脉冲 <100 fs 的激光器将受益于除了最简单的光学传输系统之外的所有色散补偿。事实上，这类激光器就需要如此。对于脉冲约为 140 fs 的激光器，其好处可能并不总是超过预补偿功能带来的额外成本和尺寸的影响。然而，它可能会为各种样品类型带来更大的使用灵活性。
如果选择具有色散补偿和 70-80 fs 量级的极短脉冲的 Ti:S 激光器，则预补偿棱镜的正确设置尤为关键。如图 6 所示，可能需要更定期地进行适当的激光操作和优化。
图 6：典型 Ti:S 激光脉冲的 GDD 设置灵敏度。较短的脉冲需要更加小心地设置 GDD，以确保优异的性能。
多短才算太短？
考虑到具有自动色散补偿的 Ti:S 激光器在市场上的成功，人们可能会问为什么不使激光脉冲尽可能短？有一些重要的限制因素共同限制了此类风险尝试。
在可调谐激光器的范围内，光学设计的局限性意味着需要在平均功率和调谐范围之间进行权衡。例如，140 fs 的 Ti:S 激光器可以从 680 nm 调谐到 1080 nm。一个 75 fs 的脉冲，由于其固有的更宽的带宽，不能调谐到如此接近 Ti:S 荧光发射光谱的边缘，因此被限制在 ~ 1050 nm。这对于想要对 mCherry 等红色荧光蛋白进行成像的用户来说非常重要。此外，当激光光谱超过 100 nm 时，其形状往往会偏离平滑的高斯分布，导致某些光谱分量的实际激发效果不佳。
在成像荧光标记的背景下还应着重非常短脉冲的更宽带宽。双光子横截面虽然通常比单光子横截面宽，但通常小于 100 nm，此外，横截面可能取决于实际脉冲宽度 [13, 14]。超宽带脉冲更常用于同时激发多个探针，而不是处理单个标记。可能的例外是谐波显微成像中，相位匹配相对与波长无关，或者是量子点的激发的时候，因为这些探针显示的是数百纳米的带宽。在这些情况下，使用非常短的脉冲会产生高信号，然而，MPE 中仅偶尔采用低于 50 fs 的脉冲。
到目前为止，色散讨论仅集中于二阶色散效应。对于更复杂的显微镜系统上的超宽带宽脉冲，三阶色散（TOD）也可能是一个考虑因素。这是对 GDD 的频率依赖性，以 fs3 为单位表示。TOD 比 GDD 更难建模，并且不能单独使用棱镜进行预补偿。对这种效应的讨论超出了我们当前的目的，但作为一般指南，脉冲约为 30 fs 或更低（或具有等效带宽的脉冲）的激光器将需要更复杂的系统来对脉冲进行相位控制，以实现高效的多光子激发 [15]。
总结
几乎所有普遍关注的非线性显微镜应用，包括体内神经科学的光遗传学和生理学，都可以使用 50-200 fs 范围内的飞秒脉冲（来自激光源）来解决。产生低于 ~100 fs 脉冲的激光源受益于预补偿的使用，以避免由于峰值功率下降而导致激励损失。在 1 微米以上的波长处，对预补偿的需求不太严格，因为所有光学材料的 GDD 在较长的波长处都会急剧下降。与所使用的波长无关，平均功率和/或峰值功率的增加最终会分别导致线性（热）或非线性损坏。两种类型的损坏之间存在权衡，但不同样品之间有所不同，而且还随波长而变化。它还取决于实验观察的时间尺度。一般来说，在样品平面获得更高峰值功率，增加了在具有高线性吸收的样品中激发更多荧光的能力和灵活性，但同时因此也更容易受到热损伤。此外，对于使用高色散光学显微镜的用户来说，增加 GDD 预补偿将在图像亮度方面带来好处，这很可能证明增加激光器的成本和复杂性是合理的。