Durchflusszytometrie
Was ist Durchflusszytometrie?
Bei der Durchflusszytometrie werden Laser eingesetzt, um verschiedene Arten von Zellen und anderen biologischen Partikeln zu zählen oder zu sortieren. Wenn Sie zum Beispiel ein Blutbild von Ihrem Arzt erhalten, wird die Analyse mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Es wird auch in der Forschung, in der Pharmazie und sogar in der Viehzucht verwendet.
Die Durchflusszytometrie ist eine weit verbreitete Methode zur zerstörungsfreien Analyse (Zählung) und/oder Sortierung von Zellen, Spermien und anderen kleinen Bioeinheiten anhand von Eigenschaften, die optisch gemessen werden können. Dabei werden die Zellen im Gänsemarsch durch eine Fließzelle gezwungen, wobei häufig eine Fließmethode namens hydrodynamische Fokussierung verwendet wird.
In der sogenannten Interaktionszone werden die Zellen dann mit einer Reihe von einem oder mehreren fokussierten Laserstrahlen abgefragt. (Siehe die Abbildung unten.) Die daraus resultierende Streuung und (Stokes-verschobene) Fluoreszenz wird von einer Optik aufgefangen und durch Filter in diskrete Wellenlängenbereiche getrennt. Die Lichtmenge in jedem Band wird dann mit einem Photodetektor gemessen.
Bei der Analyse von Blutzellen in Forschungs- und klinischen Labors werden die Zellen zunächst mit einer Reihe von Fluoreszenzmarkern (Fluorochromen) behandelt. Diese werden mit Hilfe der Antikörper-Biochemie so hergestellt, dass sie nur an bestimmte Antigene (in der Regel Proteine) auf der Außenseite der Zellen anhaften. In einigen Anwendungen können auch intrazelluläre Inhalte wie DNS in irgendeiner Weise fluoreszierend markiert werden. Während jede markierte Zelle die Interaktionszone durchläuft, kann die Analyse der relativen Intensitäten in den Wellenlängenbereichen verwendet werden, um die Population in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern zu zählen, typischerweise unter Verwendung der multivariaten Parameteranalyse. Außerdem kann die Streuung in wichtigen Winkeln gemessen werden, um Informationen über die Zellform zu ermitteln.
Der Begriff Multiparameter-Durchflusszytometrie bezieht sich auf Instrumente und Protokolle für die Zählanalyse, die Dutzende von verschiedenen Parametern testen können. Dazu müssen mehrere verschiedene Laserwellenlängen verwendet werden. Ein herkömmliches Durchflusszytometer verwendet in der Regel die gleichen vier Laserwellenlängen: 405 nm, 488 nm und 640 nm, optional auch 561 nm. Einige der komplexeren Multiparameter-Instrumente können jedoch bis zu 10 verschiedene Laser verwenden. Diese Instrumente umfassen zunehmend eine oder mehrere ultraviolette Wellenlängen, um die Bandbreite des Instruments über das sichtbare Spektrum hinaus zu erweitern und damit die Gesamtzahl der Parameter zu erhöhen. Und auf der Detektionsseite können einige dieser Instrumente sogar über 100 separate Photodetektoren enthalten.
Ein wichtiger Trend: Hersteller von konventionellen und Multiparameter-Instrumenten setzen zunehmend auf Multi-Wellenlängen-Laser-Engines, die mehrere Laser, die Fokussierungsoptik und die Steuerelektronik in einem kompakten, abgedichteten Gehäuse integrieren. Dies vereinfacht den Zusammenbau und die Ausrichtung des Geräts und erhöht außerdem seine Stabilität und die Zeit zwischen den Wartungen.
Abbildung 2: Zellsortierung mit Durchflusszytometrie. Die elektrostatische Ablenkung wird verwendet, um die Sammlung von Zellen, Spermien oder anderen Zielobjekten entsprechend ihrer Fluoreszenz- und/oder Streusignatur zu steuern.
Für einige Forschungsanwendungen wie Onkologie, Immunologie und Wirkstoffentwicklung kann die Durchflusszytometrie auch zum Sortieren von Zellen verwendet werden, d.h. zum selektiven Sammeln eines bestimmten Zelltyps, während alle anderen aussortiert werden. In einem Sortiergerät fließt der Strom vor der Interaktionszone durch eine Düse, die dafür sorgt, dass die Zellen einzeln in winzigen Tröpfchen gehalten werden, die eine geringe statische Ladung von der Düse aufnehmen. Elektrostatische Plattenelektroden werden dann aktiviert, um ein Feld zu erzeugen, das die geladenen Tröpfchen in ein Sammelröhrchen ablenkt, je nach dem vom Computer des Geräts registrierten Zelltyp.
Die Sortierung mittels Durchflusszytometrie wird auch in der Tierhaltung und Fischzucht eingesetzt. In der Tierzucht wird das Sperma von Rindern nach Geschlecht sortiert: Es gibt eine Präferenz für weibliche Spermien bei Milchkühen und männliche Spermien bei Rindern. Hier werden die Spermien des „falschen“ Geschlechts durch einen weiteren Laserstrahl zerstört. Bei der Zucht von gentechnisch veränderten Fischen können die Eier sortiert werden, um sicherzustellen, dass nur sterile erwachsene Fische gezüchtet werden, so dass kein Risiko besteht, dass entkommene Fische den Genpool der einheimischen Fische kontaminieren.